小檗碱对被动吸烟大鼠血清血管炎性因子影响的研究*

于晓明 卿力东

1 江西中医药大学,江西省南昌市 330006; 2 江西中医药大学研究生院

吸烟是最为常见的个人不良嗜好之一，相关流行病学调查显示，目前国内吸烟人数已经超过3亿，15岁及以上人群吸烟率为26.6%，其中男性成年人口吸烟比率更是高达50.5%，吸烟导致我国每年有100多万人失去生命[1]。现代医学研究证明吸烟是动脉粥样硬化重要危险因素[2]，吸烟所导致的血管炎性反应可能是动脉硬化的启动因素并且其可参与动脉粥样硬化的整个进程[3]。血清超敏C反应蛋白(hs-CRP)、白细胞介素-6(IL-6)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)是与动脉粥样硬化相关的重要血管炎性因子，本研究团队通过对分组大鼠进行持续不同时间的被动吸烟，与对照组比较，观察持续不同时间的被动吸烟对大鼠血清hs-CRP、IL-6、MMP-9等血管炎性因子的影响，并观察灌服小檗碱溶液对大鼠血清hs-CRP、IL-6、MMP-9的影响，从而探索吸烟导致动脉粥样硬化的病理机制，同时也为小檗碱防治动脉粥样硬化提供初步实验支持。

1 材料和方法

1.1 实验一

1.1.1 实验材料：(1)动物：实验选用清洁级健康雄性SD大鼠9只，体质量(200±20)g，6～8周龄，由江西中医药大学动物实验中心提供。(2)主要仪器和试剂：香烟烟雾自动发生器、被动吸烟玻璃箱(50cm×50cm×70cm)、无毒塑料鼠盒、不锈钢丝笼盖、香烟(红双喜牌卷烟，焦油含量每支11mg，烟碱含量每支1mg)、塑料瓶饮水器、酶联免疫吸附(ELISA)法测定hs-CRP、IL-6、MMP-9试剂盒(试剂盒购自上海丰寿实业有限公司)。

1.1.2 实验方法：按吸烟持续时间不同将实验大鼠随机均分为：吸烟长时间组(n=3)、吸烟短时间组(n=3)、非吸烟对照组(n=3)。大鼠采用同等方式饲养于动物房，实验动物的饲养环境温度控制在(23±1)℃，相对湿度控制在40%～70%，烟雾暴露过程中箱内浓度维持在20%，供给大鼠标准动物饲料(购买于江西中医药大学实验动物中心)和水, 水可自由取食。吸烟长时间组：大鼠于装置内给予烟雾暴露，每周熏烟6d，每天上、下午各1次，每次使用香烟15支，时间控制在每次1.5h。吸烟短时间组大鼠于装置内给予烟雾暴露，每周熏烟6d，每天上、下午各1次，每次使用香烟5支，时间控制在每次0.5h。非吸烟对照组同时放至相同装置内给予空气暴露。共建模6周，之后从腹主动脉采血，离心，分装血清，-80℃冻存。用ELISA法测定hs-CRP、IL-6、MMP-9浓度。

1.2 实验二

1.2.1 实验材料：(1)动物：实验选用清洁级健康雄性SD大鼠18只，体质量(200±20)g，6～8周龄，由江西中医药大学动物实验中心提供，随机分为吸烟长时间灌药组(n=9)、吸烟长时间组(n=9)。(2)主要仪器和试剂：同实验一。

1.2.2 实验方法：将实验大鼠随机均分为吸烟长时间组和吸烟长时间灌药组，分别进行如下处理：吸烟长时间组：SD大鼠于装置内给予烟雾暴露，每周熏烟6d，每天上、下午各1次，每次使用香烟15支，每支香烟点燃15min后换烟，每次1.5h。吸烟长时间灌药组:SD大鼠于装置内给予烟雾暴露，每周熏烟6d，每天上、下午各1次，每次使用香烟15支，时间控制在每次1.5h，同时，每天给大鼠予小檗碱溶液按60mg/(kg·d)的剂量进行灌胃。实验动物的饲养环境温度控制在(23±1)℃，相对湿度控制在40%～70%，供给大鼠标准动物饲料(购买于江西中医药大学实验动物中心)和自来水,水可自由取食。共建模6周，之后腹主动脉采血，离心，分装血清，-80℃冻存。用ELISA法测定hs-CRP、IL-6、MMP-9浓度。

2 结果

2.1 实验一结果 hs-CRP含量在吸烟长时间组中的含量低于非吸烟对照组和吸烟短时间组(P<0.05)，但在非吸烟对照组和吸烟短时间组之间无差异(P>0.05)；IL-6含量在吸烟长时间组中的含量高于非吸烟对照组和吸烟短时间组(P<0.05)，但在非吸烟对照组和吸烟短时间组之间无差异(P>0.05)。MMP-9含量在吸烟长时间组中的含量高于非吸烟对照组和吸烟短时间组(P<0.05)，但在非吸烟对照组和吸烟短时间组之间无差异(P>0.05)。见表1。

表1 被动吸烟对大鼠血清hs-CRP、IL-6、MMP-9水平影响结果

2.2 实验二结果 统计分析得出，与吸烟长时间组相比，hs-CRP含量在吸烟长时间灌药组中无显著差异(P>0.05)，但IL-6 和MMP-9含量在吸烟长时间灌药组中均有降低，有显著差异(P<0.05)。见表2。

表2 小檗碱干预对长时间吸烟大鼠血清hs-CRP、IL-6、MMP-9水平影响

3 讨论

吸烟可以分为主流烟和侧流烟，主流烟是抽吸时通过烟柱直接进入口腔的气流，而侧流烟是在没有抽吸时，从燃着的烟丝直接进入空气的气流，二者成分本质相同，只是存在量的差别[4],故而采用被动吸烟的动物实验研究吸烟的致病作用具有切实可行性，此外，主动吸烟的动物模型难以建立，也是本研究采用被动吸烟进行观察的一大原因。

吸烟是心脑血管疾病的重要致病因素，研究发现吸烟对动脉粥样硬化的危险性可随着吸烟量增大而增加[5]。尼古丁是烟草中主要有毒物质，其可以活化炎性细胞而促进炎症反应[6]。在体外实验研究中, 发现尼古丁可促使人脐静脉内皮细胞释放IL-6增多, 从而导致内皮损伤、炎症与纤溶活性紊乱。

MMP-9是基质金属蛋白酶家族中的一员，是分解细胞外基质和基底膜过程中的主要物质[7]，细胞外基质和基底膜的降解为炎症细胞及因子进入组织打开门径。MMP-9参与动脉粥样硬化斑块的发生、发展，且可能成为动脉粥样硬化斑块性质及发生脑梗死风险的预测指标[8]。IL-6是一种促炎细胞因子，因其在心脑血管事件中潜在的诊断和预测价值而越来越受到医学界关注。IL-6是引起急性期反应的信号，其不仅能诱导肝脏细胞产生CRP，也能诱导促炎因子IL-23、IL-17的释放，从而进一步促进炎症反应[9]。在脑梗死急性期时，血清IL-6表达也会显著升高，加重对脑组织的损害，从而对疾病发展产生不良影响[10]。综合以上研究可知，MMP-9、IL-6在引起血管壁损伤、促使动脉粥样硬化和脑梗死病变中均具有较为肯定的推动作用，本实验发现被动吸烟能够时间依赖地使大鼠血清IL-6、MMP-9等血管炎性因子水平升高，提示这可能是吸烟导致动脉粥样硬化的重要机制。

随着对吸烟致病作用研究的增多，有学者在研究吸烟对急性心肌梗死患者的影响时，却发现吸烟患者的预后更好，此现象被称之为“吸烟悖论”[11-12]。中医古代医家在认识到吸烟危害人体健康的同时，也发现了烟草烟气的某些治疗作用，如清代医家吴仪洛认为烟属辛温之品，能行能散，可以宣通阳气，避秽杀虫，但如果用之代茶饮，长期使用，则火气熏灼、耗伤阴血、损耗寿命[13]。本研究发现被动吸烟可以降低吸烟长时间组大鼠血清中hs-CRP含量，提示烟作为中药本草，确实存在一定的药理作用，但烟草中同时存在大量有毒物质，因此应当加强对吸烟中具有药用价值成分的研究，此外，本实验吸烟时间长短和临床中吸烟者时间比较具有相对性，且超长期吸烟者模型难以建立，因此超长期吸烟对血清中hs-CRP含量的影响还需做进一步的研究和观察。

中医学研究认为，吸烟时烟雾具有火热之性，火热可以直接灼伤脉络，亦可灼津成痰，热与痰结可以形成痰热，阻塞脉道可形成瘀血，痰热、瘀血结于损伤脉道可以导致脉痹，即动脉粥样硬化，病情进一步发展则可以导致中风、胸痹等疾病，在此病变过程中，火热灼脉是脉痹的病机关键所在[14-15]。《素问·四气调神大论》言道：“圣人不治已病治未病，不治已乱治未乱”，积极戒烟，减少生热之源，或早期使用清热泻火的药物均可预防动脉粥样硬化的形成。当前对吸烟促使动脉粥样粥样硬化和脑梗死的干预，主要在于劝诫患者戒烟以祛除致病之因，但对于难以戒烟者或吸烟已然造成病理影响尚无针对疗法，此方面研究目前也相对较少。辨证论治是中医学的特色和优势之一，通过对吸烟所致病理改变和临床症状进行辨证分析治疗，以期干预吸烟促使动脉粥样硬化进程，有利于预防动脉粥样硬化的加重以及脑梗死的发生，这也是中医学治未病中既病防变、防微杜渐思想的体现。然而，相当比例具有吸烟病因的动脉粥样硬化患者可无临床症状表现或有辨证参数不足的情况，从而不利于辨证的准确性，论治时亦缺乏疗效观察指标。根据吸烟所致的火热灼脉病机，从火热论治动脉粥样硬化时，可以在宏观辨证的基础上结合微观辨证，参考血清IL-6、MMP-9水平，有利于发挥宏观辨证的整体性优势和微观辨证的客观性优势，提高辨证治疗的准确性。

黄连始载于《神农本草经》,列为上品，该药味苦性寒, 归心、脾、 胃、肝、胆、大肠经, 具有清热燥湿、泻火解毒的功效。黄连的有效成分为小檗碱，随着现代药理研究发现小檗碱具有降血脂、降血糖、降血压、抗心律失常、扩张冠状血管等作用。张金霞等[16]研究发现小檗碱可能通过干预CCL2、HMOX1、MMP-9等关键靶点，调控流体剪切力以及IL-17、TNF等信号通路发挥干预颈动脉粥样硬化的作用。刘琴等[17]研究发现小檗碱能够减轻高糖及高脂引起的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块沉积并改善斑块的脆弱性。高脂血症是动脉粥样硬化的主要危险因素之一，谭文倩等[18]通过实验研究发现低剂量小檗碱可以促进正常饮食小鼠肠道短链脂肪酸和胆汁酸产生，降低正常饮食小鼠血清三酰甘油水平。本实验发现与吸烟长时间组比较，灌服小檗碱的吸烟长时间组大鼠血清中IL-6、MMP-9水平均较低，两组对比具有显著性差异。因此，提示灌服小檗碱溶液可以抑制被动吸烟大鼠血清IL-6、MMP-9水平的升高，从而可以起到预防和治疗动脉粥样硬化的作用。

本项研究发现被动吸烟能够时间依赖地使大鼠血清IL-6、MMP-9等血管炎性因子水平升高，提示这可能是吸烟导致动脉粥样硬化的具体病理学机制之一。灌服小檗碱溶液可以抑制被动吸烟大鼠血清IL-6、MMP-9水平的升高，从而可以起到预防和治疗动脉粥样硬化的作用，同时也为中医探讨吸烟导致的火热灼脉理论及清热泻火法治疗动脉硬化提供实验室证据。后期笔者将以本实验为基础进一步开发以黄连为主药的中成药的药效学研究。