作孚连蕊茶的形态特征观测和SNP位点分析

沈 琳, 周 利, 张亚利

(1. 上海上园苗木有限公司, 上海 200083; 2. 南山植物园, 重庆 400060; 3. 上海市农业科学院林木果树研究所, 上海 201403)

近年来，山茶属(CamelliaLinn.)连蕊茶组(Sect.TheopsisCohen-Stuart)植物因其花小而密等观赏特征受到研究者及应用者的关注与喜爱[1,2]。作者在野外调查中观测到重庆缙云山作孚连蕊茶(CamelliatsofuiS. S. Chien)的花梗及萼片总长以及花蕾和花瓣颜色等形态特征与原始文献[3]描述存在差异，这些差异在作孚连蕊茶作为景观应用和育种材料开发中具有重要价值。

Super-GBS技术是基于GBS进一步发展出的简化基因组测序技术，因其能够获得更多、更准确的SNP/Indel等优势，目前已逐步运用到分子标记开发和进化分析等研究中[4]。近年来，作者先后开展山茶属连蕊茶组和毛蕊茶组(Sect.EriandriaCohen-Stuart)不同物种、同一物种不同居群以及同一物种同一居群不同单株样本的Super-GBS测序与分析，其中，两两样本间的相似度比较在进行分类鉴定及进化分析方面具有一定的参考意义。

本研究对作孚连蕊茶在原生境及迁地栽培环境中的形态特征进行观测和比较，探索Super-GBS技术在开展形态特征存在差异材料相似度比较中的应用，以期为作孚连蕊茶的景观应用和种质创新等提供支撑，同时也为其今后的分类地位探讨提供借鉴。

1 材料和方法

1.1 材料

供试作孚连蕊茶野生居群主要分布于重庆缙云山(东经106°23′、北纬29°49′)海拔约800 m的常绿阔叶林、针阔混交林和毛竹〔Phyllostachysedulis(Carriere) J. Houzeau〕林内；迁地栽培材料种植于浙江金华的国际山茶物种园内的连蕊茶组和毛蕊茶组资源种质区。通过采集标本、形态特征记录和拍照，比对作孚连蕊茶原始文献[3]描述及林祁等[5]指定的后选模式标本的形态特征，鉴定为作孚连蕊茶。凭证标本保存于上海辰山植物标本馆(CSH)。

Super-GBS测序与分析选取3个花部形态特征存在差异的作孚连蕊茶单株。其中，O-1单株(凭证标本号CSH0187825)采自缙云山，其花梗及萼片总长8～10 mm，花近白色，花柱极浅3裂，裂片长约1 mm；O-2单株(凭证标本号CSH0187824)采自缙云山，其花梗及萼片总长6～8 mm，花瓣白色或外轮花瓣被紫红色，花柱浅3裂，裂片长约3 mm；E-1单株(凭证标本号CSH0187846)采自国际山茶物种园，其花梗及萼片总长10～12 mm，花瓣被紫红色，花柱极浅3裂，裂片长约1 mm。

1.2 方法

1.2.1 植物形态特征观测 结合原始文献的形态特征描述，对生活型、枝干被毛情况、叶片长、叶片宽、花蕾着生方式、花蕾颜色、花梗及萼片总长、花瓣颜色、雄蕊被毛情况、花柱裂片长度、果实性状、果实大小、种子大小等数量和质量性状进行观测，数量性状随机选取15个样本进行数据收集。

1.2.2 Super-GBS测序与分析 于春季采集幼嫩叶片，用锡箔纸包好后迅速放入液氮中，带回实验室后置于-80 ℃超低温冰箱保存，文库构建及测序由青岛欧易生物科技有限公司完成。采用植物基因组DNA试剂盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕提取DNA，样品DNA抽提质检合格后，运用Super-GBS技术构建测序文库[4]。测序结果采用Super-GBS的信息分析流程进行数据质控、数据比对和基因分型[6-10]。本研究中的3份单株样本与72份连蕊茶组和毛蕊茶组的样本一起开展测序与分析。在整体分析SNP位点的基础上，对O-1、O-2和E-1 3个样本进行相似度〔相似度=(两两分型一致且不缺失/两两有分型且不缺失)×100%〕比较。

2 结果和分析

2.1 野外观测与原始文献描述的比较

整体而言，在原生境和迁地栽培环境，作孚连蕊茶的叶披针形或长圆形及游离花丝被毛等主要识别特征与原始文献描述基本一致，但其生活型和花部特征等性状存在差异。原始文献描述中生活型为灌木，而在原生境中存在灌木和小乔木(图1-A)2种生活型；原始文献描述中花1～2朵顶生，白色或初花时外部花瓣略被紫红色，而在原生境和迁地栽培环境中均为顶生和腋生，花蕾白色或紫红色(图1-B)；原始文献描述中花梗长5～6 mm，萼片长2 mm，而在原生境和迁地栽培环境中花梗及萼片总长6～12 mm，且在迁地栽培环境中花瓣存在全部被紫红色的特征(图1-D1,D2,D3)；原始文献描述中游离花丝疏被毛，柱头3裂，裂片长1 mm，而在原生境和迁地栽培环境中游离花丝疏被毛或近无毛，柱头3裂，裂片长不足1 mm，或1～3 mm(图1-D1)。

原始文献描述对作孚连蕊茶幼叶颜色、果实及种子等性状未做说明。原生境和迁地栽培环境中作孚连蕊茶幼叶绿色或紫红色；蒴果近球形(图1-C)，横径5～13 mm，1室，种子1粒；种子近球形，深褐色；盛花期为3月至4月，为连蕊茶组中花期较晚的资源。

A. 小乔木Small tree. B. 花蕾Flower bud. C. 果实Fruit. D1,D2,D3. 花Flower: D1. 花瓣白色White petals; D2. 外轮花瓣被紫红色Outer petals with purplish red; D3. 花瓣被紫红色Petals with purplish red.

2.2 SNP位点相似度的比较

基于Super-GBS技术的SNP位点相似度的比较结果表明：供试3个样本共筛选出两两有分型且不缺失的SNP位点163 371个，3个样本共有SNP位点147 436个，其中，O-1和O-2两两分型一致且不缺失的位点4 942个，共有位点152 378个，相似度为93.27%；E-1和O-1两两分型一致且不缺失的位点4 747个，共有位点152 183个，相似度为93.15%；E-1和O-2两两分型一致且不缺失的位点4 828个，共有位点152 264个，相似度为93.20%；E-1、O-1和O-2特异的位点分别为6 360、6 246和6 165个。

3 讨论和结论

与原始文献描述相比，作孚连蕊茶在原生境及迁地栽培环境的形态特征差异主要体现在生活型、花蕾着生方式和花瓣颜色等性状，作孚连蕊茶的主要观赏特征及典型识别特征可以概括为：灌木或小乔木；叶披针形或长圆形，叶长3.0～5.5 cm，宽1.2～1.7 cm；花顶生和腋生，花蕾白色或紫红色；花梗及萼片总长6～12 mm，苞片散生于花梗；花瓣白色，或外轮花瓣被紫红色，或全部花瓣紫被红色；游离花丝多疏被毛；子房及花柱无毛；盛花期3月至4月，为连蕊茶组中花期较晚的种类。作孚连蕊茶在生活型、叶及花等性状上的特点，可使其成为园林景观、种质创新的优秀资源，在后续的开发应用中，可关注花蕾和花紫红色等形态特征。SNP位点相似度分析结果显示：供试3个样本两两之间的相似度均在93%以上，结合作者对Super-GBS测序与分析中同一物种不同单株样本相似度比较的结果，初步判断3个单株为作孚连蕊茶的种内变异。

本研究沿用Sealy[11]和张宏达[12]将作孚连蕊茶作为独立物种的观点，但闵天禄[13]将作孚连蕊茶作为毛蕊柃叶连蕊茶〔Camelliaeuryoidesvar.nokoensis(Hayata) Ming〕的异名，吕林玲[14]将其处理为Camelliasynapticavar.parviovata(Chang) Ming 的异名，可见该物种的分类地位仍需进一步研究。

致谢：感谢上海辰山植物园杜诚高级工程师和葛斌杰高级工程师在腊叶标本及原始文献方面给予的帮助和支持！