基于网络药理学和分子对接技术探讨竹节参总皂苷改善糖脂代谢紊乱的作用机制

张 钰，周昌园，杨 宝，涂 星，胡泽华，文德鉴，聂 娟，陈家艺

1.湖北民族大学附属民大医院(湖北 恩施 445000)2.湖北民族大学医学部(湖北 恩施 445000)3.湖北民族大学化学与环境工程学院(湖北 恩施 445000)4.湖北民族大学武陵山中药材检验检测中心(湖北 恩施 445000)

由于生活水平显著提高，以及遗传和环境等因素影响，以高血脂和高血糖为主要表现的糖脂代谢紊乱性疾病的发病率呈现急剧上升趋势，严重威胁广大民众的健康[1-2]。糖脂代谢紊乱性疾病的发病机制复杂，可累及全身多个系统和器官，需要从整体上进行综合防治[1-2]。目前临床上多采用单病单治的策略，常用药物的作用靶点较为单一，最终治疗效果不尽人意。中医药在防治糖脂代谢紊乱性疾病方面取得较好的效果，具有多成分、多靶点、多通路、联合增效、异病同治、不良反应低的优势[1]。

竹节参为五加科植物竹节参(PanaxjaponicusC.A.Mey.)的干燥根茎，具有散瘀止血、消肿止痛、祛痰止咳、补虚强壮的功效，是恩施地区的道地中药材，药用资源丰富[3-4]。相关研究表明[5-7]竹节参富含齐墩果烷型和达玛烷型三萜皂苷，其总皂苷具有较好的降血脂和降血糖活性，但是潜在的作用靶点和机制尚不清楚。网络药理学是以系统生物学为理论基础，结合了信息网络学和药理学的一门学科，与中药的多成分、多靶点、多途径作用特点不谋而合，在中医药领域被广泛应用于药理机制研究、活性成分筛选、配伍规律等研究，并取得了较好的效果[8]。本研究拟采用网络药理学方法筛选和预测竹节参总皂苷改善糖脂代谢紊乱的活性成分和作用靶点，构建“成分-靶点”网络图，探讨其潜在作用机制，为其新药开发和临床应用提供参考资料。

1 材料与方法

1.1筛选活性成分及预测靶点通过知网(https://www.cnki.net)、Web of science(https://access.clarivate.com)、PubChem(pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)数据库查找竹节参总皂苷的活性成分及其对应的简化分子线性输入规范(Simplified molecular input line entry,Smiles)号，将Smiles号输入Swiss Target Prediction数据库(www.swisstargetprediction.ch)进行靶点预测，以“智人”且“Probability>0.1”作为初步筛选条件；使用Uniport蛋白数据库(https://www.uniprot.org)，对筛选的靶点进行信息标准化并删除重复值。

1.2筛选疾病靶点通过GeneCards数据库(www.genecards.org)、OMIM数据库(www.omim.org)和NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/)以“glycolipid metabolism disorder”为检索词检索相关靶点，筛选疾病的相关靶点，合并3个疾病数据库靶点，并使用R语言绘制韦恩图。

1.3筛选药物-疾病共有靶点及构建蛋白相互作用(PPI)网络使用R语言对药物和疾病靶点取交集，将共有靶点输入String数据库(https://string-db.org/)构建PPI网络模型，设置最小相互作用阈值“custom value”>0.40，同时显示设置隐藏游离点，其余均为默认值，得到PPI网络。将PPI数据导入Cytoscape软件进行可视化分析，使用CytoNCA插件对PPI网络数据进行网络拓扑学分析。

1.4构建“药物-活性成分-作用靶点”网络将药物活性成分和作用靶点数据导入Cytoscape软件，构建“药物-活性成分-作用靶点”网络图，使用Network Analyzer工具进行网络拓扑学分析，以连接度、介度和紧密度的阈值中位数为条件，分析竹节参总皂苷发挥改善糖脂代谢的主要活性成分。

1.5基因本体(GO)功能和通路富集分析运用DAVID平台(https://David.ncifcrf.gov/)对共同靶点进行GO功能和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析，设定P<0.05，并使用在线作图平台微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)对其进行可视化处理。

1.6分子对接验证根据Degree值排名前3位选择关键活性成分和核心靶点，对其进行分子对接验证。使用Chemdraw软件构建关键活性成分的3D结构，利用PDB数据库下载核心靶点蛋白数据，采用PyMOL和Auto Dock Tools软件进行常规处理及分子对接。

2 结果

2.1活性成分筛选和靶点预测结果通过知网、Web of science、PubChem数据库从竹节参总皂苷中初步筛选得到39个活性成分(表1)；在Swiss Target Prediction数据库进行39个活性成分的靶点预测，将其结果输入Uniprot数据库进行靶基因匹配，并删除重复值，最终获得竹节参总皂苷活性成分作用靶点259个。

表1 竹节参总皂苷中活性成分的相关信息

2.2疾病相关靶点筛选结果从Gene cards、OMIM、NCBI数据库分别筛选得到955、184、19个疾病靶点，合并去重后得到1 125个疾病靶点(图1)。

图1 疾病相关靶点韦恩图

2.3药物-疾病共有靶点筛选结果及PPI网络结果药物靶点与疾病靶点取交集后得到60个靶点(图2)。PPI网络结果显示(图3)，共有60个节点、426条边，平均节点度为14.2。经过拓扑分析后发现，排名前9的靶点为AKT、JUN、VEGFA、ESR1、CASP3、MTOR、STAT3、CCND1、MAPK1(表2)，可能为竹节参总皂苷发挥改善糖脂代谢作用的重要靶点。

图3 共有靶点PPI网络图

表2 拓扑分析排名前9靶点

图2 竹节参总皂苷活性成分的靶点和糖脂代谢紊乱疾病靶点韦恩图

2.4“药物-活性成分-作用靶点”网络分析结果将活性成分和作用靶点数据导入Cytoscape软件，构建“药物-活性成分-作用靶点”网络图(图4)。共100个节点，408条边，形状越大，代表Degree值越大。筛选出Degree值排前3的活性成分(表3)，即23(原人参三醇，Protopanaxatriol)、26(人参三醇，Panaxotriol)、25(人参二醇，Panaxadiol)，提示竹节参总皂苷能通过多成分、多靶点干预糖脂代谢。

表3 竹节参总皂苷活性成分拓扑分析

注：橙色菱形为竹节参总皂苷活性成分，蓝色圆形为作用靶点。

2.5GO功能富集和KEGG富集通路结果GO功能富集分析主要包括生物过程(Biological Processes，BP)、细胞组成(Cellular Components，CC)和分子功能(Molecular Functions，MF)。其中BP主要富集为信号传导、基因表达的正向调节、对RNA聚合酶II启动子的转录进行正向调节、蛋白质磷酸化和基因表达的负向调节等(图5)；CC主要富集于质膜、细胞膜、胞浆、细胞核、细胞质等(图5)；MF主要富集于蛋白质结合、酶结合、ATP结合和蛋白激酶活性等(图5)。KEGG分析主要富集于PI3K-Akt、MAPK信号通路等，选择相关的通路进行可视化分析(图6和图7)。

图5 GO功能分析

图6 KEGG通路分析

图7 PI3K-Akt信号通路

2.6分子对接结果根据Degree值排名，原人参三醇、人参三醇和人参二醇为关键活性成分，AKT1、JUN、VEGFA为核心靶点，分别对其进行分子对接，结果显示关键活性成分与核心靶点的结合性均较好(表4和图8)。

表4 关键活性成分与核心蛋白靶点的结合能(kJ·moL-1)

注：A为原人参三醇与VEGFA；B为原人参三醇与JUN；C为人参三醇与VEGFA；D为人参三醇与JUN。

3 讨论

糖脂代谢紊乱是由饮食、环境、遗传等多种因素参与，以高血脂、高血糖为基本特征，最终累及全身多个系统和器官功能障碍的一系列疾病的总称，临床上常表现为糖尿病、高血脂、肥胖、冠心病、非酒精性脂肪肝等，其发病机制主要涉及神经内分泌紊乱、胰岛素抵抗、炎性反应、氧化应激、肠道菌群结构或多样性失调等[2]。由于中药多成分、多途径、多靶点、协同整合的作用特点，目前在糖脂代谢紊乱相关疾病中受到了越来越多的关注。竹节参总皂苷在多项药理学研究中被证实具有较好的调节糖脂代谢紊乱作用，能够显著改善HepG2细胞的脂质代谢，改善肥胖小鼠/大鼠的胰岛素抵抗、脂质代谢和脂肪性肝病[6-7,9-11]。本研究通过网络药理学方法从竹节参总皂苷中筛选得到39种活性成分，其中原人参三醇、人参三醇、人参二醇可能是竹节参总皂苷改善糖脂代谢的关键成分。相关药理学研究表明[12-13]原人参三醇、人参三醇、人参二醇具有较好的调节糖脂代谢、改善胰岛素抵抗、保护心脑血管作用。

通过药物-活性成分-作用靶点筛选及PPI网络分析表明，AKT1、JUN、VEGFA、ESR1、CASP3、mTOR、STAT3、CCND1、MAPK1可能为竹节参总皂苷发挥改善糖脂代谢作用的重要靶点。AKT1在细胞增殖、代谢和凋亡等活动中扮演着重要角色，相关研究[14]表明，AKT1作为胰岛素信号通路IRS-PI3K-AKT中的关键靶点蛋白，能通过多种途径改善糖代谢，如降低FoxO1、PEPCK、G6Pase的表达抑制肝糖异生，或促进GK和PFK的表达加速肝脏葡萄糖的分解。JUN可以被高糖条件激活，进而诱发炎症反应和细胞凋亡，并增强相关凋亡基因的转录活性，最终导致胰岛β细胞损伤和凋亡，影响机体糖代谢[14]。VEGFA是VEGF家族中的一员，在新诊断的2型糖尿病患者中发现血清中的VEGF水平出现异常升高，并且参与糖脂代谢和胰岛素抵抗[15]。另有研究表明[16]，在ESR1基因敲除的小鼠白色脂肪组织中的VEGFA表达相对较低。CASP3是Caspase家族中的一种重要蛋白酶，在糖脂代谢紊乱模型中与胰岛β细胞的凋亡密切相关[17]。mTOR是细胞内重要的能量感受分子，在信号通路激活状态下能够促进脂质的合成与代谢以及能量的储存和利用，其能够通过PI3K/AKT/mTOR信号通路影响糖代谢，通过影响HIF1-α、SREBP和ChREBP的表达影响脂质代谢，目前已成为糖脂代谢紊乱机制研究的热点[18]。STAT3信号通路及相关蛋白在缺血再灌注心肌细胞凋亡及氧化应激损伤相关心血管系统疾病中发挥着重要作用。陈乘波等[19]研究表明，川芎嗪可以通过调控线粒体自噬及JAK2/STAT3信号通路缓解心肌缺血再灌注损伤。MAPK1信号转导通路存在于大多数细胞内，主要参与细胞的分化和增值。以上信息提示竹节参总皂苷是以多成分、多靶点的方法发挥改善糖脂代谢紊乱的作用。

KEGG富集分析结果表明，共有靶点主要富集于糖脂代谢相关的PI3K-Akt、MAPK信号通路。胰岛素是机体糖脂代谢及能量代谢的关键调控分子，而PI3K/Akt信号通路是胰岛素调控糖代谢的重要途径，同时也是机体发生胰岛素抵抗的重要原因，在维持机体血糖、血脂代谢平衡等方面发挥着重要作用[20]。目前PI3K/Akt信号通路是中医药防治糖脂代谢紊乱的重要途径和靶点之一，如匙羹藤总皂苷[21]、白虎汤[22]等。MAPK信号通路是生物体内重要的信号转导系统之一，为三级激酶模式，参与细胞的生长分化、炎症反应等多种生物过程。p38信号通路是MAPK家族的重要组成部分，相关研究表明[23]抑制p38 MAPK信号可以显著改善糖脂代谢水平和胰岛素水平。

综上所述，竹节参总皂苷通过多成分-多靶点-多途径协同发挥作用。原人参三醇、人参三醇和人参二醇可能是竹节参总皂苷改善糖脂代谢紊乱的关键成分，可能是通过PI3K-Akt和MAPK信号通路发挥作用。鉴于网络药理学和分子对接技术的局限性，后期还应在细胞或者动物水平进一步验证，以期为其作用机制研究提供参考资料。