循经取穴对缺氧诱导心肌损伤大鼠HIF-1α、iNOS及NO表达的影响

修春英，陈 白，郑秋洪，曾屹生

（1.福建中医药大学附属康复医院，福建 福州 350003；2.福建省康复技术重点实验室，福建 福州 350003；3.福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350003）

缺氧是临床常见的病理过程，长期或反复地处于缺氧状态，会导致心血管系统功能紊乱，是心血管疾病的主要致病因素之一［1］。本课题组前期研究表明［2-5］，针刺手厥阴心包经穴位，对缺氧状态下的心功能具有良好的调节作用，初步证明了手厥阴心包经对于缺氧诱导的心血管病理改变具有保护作用。在缺氧状态下，心肌细胞的损伤与缺氧诱导因子1α（HIF-1α）介导的诱导型一氧化氮合酶（iNOS）/一氧化氮（NO）通路相关。据此，本研究通过建立慢性缺氧大鼠模型，观察电针内关穴对大鼠心肌组织中HIF-1α、iNOS 的mRNA 和蛋白水平，以及心肌组织NO 表达的影响，探讨循手厥阴心包经取穴电针通过影响HIF-1α介导的iNOS/NO通路干预心肌缺氧损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 SD 大鼠100 只，雄性，体质量180～220 g，由福建医科大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK（闽）2016-0006。随机分为5 组：对照组、模型组、循经取穴组（电针内关穴）、非循经取穴组（电针列缺穴）、非经非穴组（电针大鼠胁下一固定点），每组20只。

1.2 主要仪器与试剂 7500 Fast Real-Time PCR Sys⁃tem（美国Applied Biosystems 公司）；ALLEGRA 64R 型台式高速冷冻离心机（美国Beckman 公司）；CODA 型全自动酶免分析仪（美国Bio-Rad 公司）；1 寸华佗牌一次性使用无菌针灸针（苏州医疗用品厂有限公司，规格：0.25 mm×25 mm）；WQ-10D1 型多用电子穴位测定治疗仪（北京市海淀东华电子仪器厂）。低氧混合气体（12%O2和88%N2，福州中铭工业气体有限公司）；Trizol Reagent（美国Invitrogen 公司，货号：10296-028）；SYBY premix ExTaq TM（日本TakaRa 公司，货号：RR390A）；Prime-Script 逆转录试剂盒（日本TakaRa公司，货号：RR037A）；细胞和组织总蛋白抽提试剂盒（上海康成生物工程有限公司，货号：KC-415）；BCA 蛋白质定量试剂盒（上海康成生物工程有限公司，货号：KC-430）。

1.3 模型建立 参照文献［6］的造模方法，将模型组、循经取穴组、非循经取穴组、非经非穴组大鼠置于低氧舱内，持续通入低氧混合气体（12%O2和88%N2）12 h，随后通入空气12 h，连续12 d；对照组在相同的舱体内通入空气。低氧舱内CO2浓度维持在0～0.8%范围内，压强、温度和湿度保持一致。造模成功标准：大鼠在造模过程出现躁动、活动剧烈、甩头和呼吸急促并加深的现象，随着时间推进，逐渐出现竖毛、蜷缩、扎堆的现象。对照组大鼠活动如常，呼吸深度、频率基本不变。

1.4 干预方法 慢性缺氧模型复制成功后，循经取穴组、非循经取穴组、非经非穴组分别针刺内关穴、列缺穴、胁下固定点（髂嵴上10 mm，后正中线旁开20 mm处），穴位定位方法参照《实验针灸学》［7］。刺激方法：电针（疏密波，刺激频率10/20 Hz，强度以肢体出现颤动为度）。每天1 次，每次30 min，连续5 d。对照组和模型组不进行干预。

1.5 实时定量PCR 法检测HIF-1α、iNOS 的mRNA 表达 ①采用Trizol 法抽提大鼠心肌组织的总RNA，通过OD260/OD280值进行RNA 纯度及含量的测定。取2µg 总RNA 进行逆转录反应，引物序列如下：HIF-1α上游引物5'-CAAAAC ACA CAG CGA AGC-3'，下游引物5'-TCAACCCAGACATATCCA CC-3'，扩增产物长度473 bp；iNOS 上游引物5' -GGGACTGGACTTT⁃TAGAGACGC-3'，下游引物5'- GGAATAGCACCT⁃GGGGTTTTC-3'，扩增产物长度224 bp；ACTB 上游引物5'-CGAG TACAACCTTCTTGCAGC3'，下游引物5'-ACCCATACCCACCATCACAC3'，扩增产物长度202 bp。②去除基因组DNA：用脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ）消化RNA样品，去除其中可能含有的基因组DNA。RNA 纯化及质量检测：用RNA 纯化试剂盒纯化RNA，紫外吸收测定法测RNA 浓度，变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA 完整性及纯度。③cDNA合成：逆转录试剂盒合成cDNA。④实时定量PCR：将配好的混合液加到PCR Array 对应的孔中，然后置PCR Ar⁃ray 于实时定量PCR 仪进行PCR 反应。反应条件：94 ℃预变性5 min 后，94 ℃变性30 s，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30 个循环后72 ℃维持5 min。数据分析：采用ΔΔCt 方法，先计算每个样本的ΔCt，ΔΔCt =ΔCt（各组别）-ΔCt（对照组），最后通过2-ΔΔCt计算各组别与对照组对应基因的表达差异。

1.6 采用Western Blot 法测定电针前后HIF-1α、iNOS蛋白水平的变化 将心肌组织按1∶6加入匀浆缓冲液研磨成组织匀浆，离心10 min，离心速度为10 200 rpm，离心半径为8.65 cm。取上清液，匀浆液置-20 ℃冰箱贮存备用。提取的匀浆标本用Bradford法进行蛋白定量。取等量样品，加入等体积的缓冲液混匀，在沸水中煮120 s，以10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，分离的蛋白用半干电转移法转移到PVDF 膜，室温下用封闭液封闭1 h后加入用封闭液稀释的一抗（1∶1 000）4 ℃过夜；洗液洗涤5 min 3 次，10 min 1 次；辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1 000 稀释）孵育2 h，用化学发光法显色，X 射线底片曝光，显示出各组大鼠蛋白印迹，用GAPDH 作为内参照，比较测定HIF-1α、iNOS水平表达的相对值。

1.7 采用硝酸还原酶法测定心肌组织NO 的表达水平 取心肌组织块，加9 倍体积预冷的生理盐水制成10%组织匀浆，1 500 r/min 离心5 min，取上清液，采用硝酸还原酶法测定NO2-/NO3-含量。

1.8 统计学方法 采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，在方差齐性的情况下，两两比较采用LSD检验，方差不齐情况下用Dunnett’s T3检验。

2 结 果

2.1 各组大鼠HIF-1α、iNOS 的mRNA 表达水平变化 与对照组比较，模型组大鼠心肌组织HIF-1α、iN⁃OS 的mRNA 表达显著增加（P<0.01）；与模型组、非循经取穴组、非经非穴组比较，循经取穴组（针刺内关穴）能增加HIF-1α 的mRNA 表达量，降低iNOS 的mRNA表达量（均P<0.01）。见表1。

表1 各组大鼠HIF-1α、iNOS的mRNA表达水平比较（±s）

表1 各组大鼠HIF-1α、iNOS的mRNA表达水平比较（±s）

注：与对照组比较，①P<0.01；与模型组比较，②P<0.01；与非循经取穴组比较，③P<0.01；与非经非穴组比较，④P<0.01

iNOS 1 1.77±0.18①1.57±0.11②③④1.74±0.14 1.82±0.15组 别对照组模型组循经取穴组非循经取穴组非经非穴组n 20 20 20 20 20 HIF-1α 1 1.81±0.09①3.41±0.36②③④2.24±0.40 1.95±0.27

2.2 各组大鼠HIF-1α、iNOS 蛋白表达水平的比较与对照组比较，模型组大鼠心肌组织HIF-1α、iNOS 的蛋白表达显著增加（P<0.01）；与模型组比较，循经取穴组HIF-1α 的蛋白表达显著增加，iNOS 的蛋白表达显著下降（P<0.01）；与非循经取穴组、非经非穴组比较，循经取穴组能增加HIF-1α 的蛋白表达量（P<0.01）。见表2、图1。

表2 各组大鼠HIF-1α、iNOS的蛋白表达水平比较（±s）

表2 各组大鼠HIF-1α、iNOS的蛋白表达水平比较（±s）

注：与对照组比较，①P<0.01；与模型组比较，②P<0.01；与非循经取穴组比较，③P<0.01；与非经非穴组比较，④P<0.01

iNOS 0.62±0.14 0.74±0.13①0.64±0.11②0.70±0.08 0.68±0.09组 别对照组模型组循经取穴组非循经取穴组非经非穴组n 20 20 20 20 20 HIF-1α 0.63±0.06 0.72±0.10①0.83±0.08②③④0.74±0.08 0.71±0.09

图1 各组大鼠心肌组织HIF-1α、iNOS的蛋白表达情况

2.3 各组大鼠心肌组织NO 表达水平比较 见表3。与对照组比较，模型组大鼠心肌组织的NO 表达显著增加（P<0.01）；与模型组、非循经取穴组、非经非穴组比较，循经取穴组能降低NO 的表达含量（均P<0.01）。

表3 各组大鼠心肌组织NO表达水平比较 （±s）

表3 各组大鼠心肌组织NO表达水平比较 （±s）

注：与对照组比较，①P<0.01；与模型组比较，②P<0.01；与非循经取穴组比较，③P<0.01；与非经非穴组比较，④P<0.01

NO 35.30±2.80 46.70±3.83①31.41±2.05②③④40.82±2.32 41.55±2.30组 别对照组模型组循经取穴组非循经取穴组非经非穴组n 20 20 20 20 20

3 讨 论

据《中国心血管健康与疾病报告2020 概要》［8］显示，心血管病死亡占我国城乡居民总死亡原因的首位，农村为46.66%，城市为43.81%。心血管病给居民和社会带来的经济负担日渐加重，已成为重大的公共卫生问题，加强政府主导的心血管病防治工作刻不容缓。心肌缺氧缺血是心血管疾病的主要致病因素之一［9］，HIF-1α 是目前发现在低氧状态下发挥活性的唯一特异转录因子，在缺氧诱导基因的表达调节过程中起关键作用。前期和相关研究显示［5，10-12］，HIF-1α能使血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的转录和表达增强，增加血管生成，使血液到达缺氧部位，从而降低因缺氧带给机体的损伤。但同时其又可激活iNOS 的表达，iNOS 的过量表达催化产生NO，由于NO 具有细胞毒作用，可能是心血管疾病的病理因素之一。以上说明一方面HIF-1α 可以发挥心肌保护作用，另一方面又有可能因为激活别的调控靶点而加重心肌组织的损伤。在循经取穴状态下，对缺氧下心肌组织的HIF-1α、iNOS、NO 表达水平是否有所影响，是本研究观察的重点。

《灵枢·经脉》曰“心主手厥阴心包络之脉，起于胸中，出属心包络”，经脉所过，主治所及，针刺手厥阴心包经穴位具有良好的心肌保护效应［13］。前期研究显示，循手厥阴心包经取穴，电针内关、郄门、曲泽穴对缺氧状态下的心功能具有良好的调节作用［2-4］。本研究选取内关穴作为循经取穴组的观察穴位，是因为内关穴作为手厥阴心包经的络穴、八脉交会穴，是临床手厥阴心包经治疗心血管疾病最常用、最具代表意义的穴位。非循经取穴组选用穴位为列缺，列缺穴是手太阴肺经的络穴和八脉交会穴，该穴位并不直接与心相通，因此作为非循经取穴组的参考穴位。而非经非穴组选取胁下固定点，避开了穴位分布区域。

本研究结果显示，与对照组比较，模型组大鼠心肌组织HIF-1α、iNOS mRNA 的表达增加，同时蛋白含量也相应增加（P<0.01），证实了在慢性缺氧模型下，HIF-1α发挥活性，并激活其主要靶基因iNOS的表达。循经取穴组能增加慢性缺氧模型大鼠HIF-1α 的mRNA 和蛋白的表达含量，表明针刺内关穴可以发挥HIF-1α 的抗缺氧作用，对缺氧诱导的心肌损伤具有保护作用。研究表明［14］，HIF-1α 蛋白表达的上调与iNOS活性、NO水平的增加关系密切，三者之间存在着正向调节的作用，但本研究结果发现，电针内关穴可持续增加HIF-1α的mRNA和蛋白的表达含量，但iNOS和NO 的水平并未相应的增加，反而出现明显的下降，针刺的效应类似于iNOS 拮抗剂的作用，似乎与前述的结果矛盾。分析其原因，可能与以下两个方面有关：首先，可能与HIF-1α 调节其余的靶基因相关，HIF-1α 通过调节如VEGF、促红细胞生成素（erythro⁃poietin，EPO）等靶基因而发挥其心肌保护作用。这个结果在王克胜等［15］的研究中得到证实：在缺血缺氧条件下，HIF-1α 表达的增加并未加重心肺组织的损伤，反而使损伤得到明显的减轻，这可能与HIF-1α 能够调节VEGF、EPO 等数百种涉及缺氧条件下细胞适应和存活的靶基因的表达有关。其次，可能与电针的双向调节作用有关，电针内关穴对于机体异常升高的iNOS 和NO 水平起降低的调节作用，通过降低心肌组织的iNOS 和NO 水平，发挥其心肌保护作用。其双向调节的机制，有待于课题组后续做进一步的研究。

经脉的特异性研究一直是针灸学科研究的重点和热点，本研究从循经取穴组、非循经取穴组以及非经非穴组3 个组别探讨经穴的特异性作用，发现循手厥阴心包经取穴具有独特的作用，进一步证实了穴位的特异性，以及临床循经取穴的重要性。另外，针刺内关穴具有对抗缺氧诱导心肌损伤的作用，其作用机制可能与调控HIF-1α 及其下游的iNOS、NO 表达相关，从而为临床应用手厥阴心包经防治心肌缺氧所致疾病提供理论依据。