“秩边透水道”针法对子宫内膜异位症大鼠PI3K/AKT/mTOR信号通路及血清指标的影响

张 黎，王海军△，刘 璇，曹玉霞，李佳茹，樊 青，马梦娜

(1.山西中医药大学，山西 晋中 030619；2.山西省针灸医院，山西 太原 030006)

子宫内膜异位症(Endometriosis，EMs)，简称“内异症”，是一种在子宫腔内壁以外的部位活动的疾病，其侵犯能力强，涉及范围广。轻则可引起疼痛、不孕与产科并发症[1]，重则导致癌变、继发腹水[2-3]。Dahiya等[4]验证了子宫内膜异位症女性患有卵巢癌、子宫内膜癌与乳腺癌的概率分别为6.2%、4.1%与1.8%。

关于内异症的发病机制，最早提出的是异位内膜种植学说，之后有体腔上皮化生学说、免疫学说等[5-6]，现Matsuzaki S提出纤维化参与EMs的发展[7]，但其分子病理机制尚未明确。Leconte研究发现 PI3K/Akt/mTOR信号通路与EMs关系密切[8]。Omero等[9]利用公共数据库提供的原始数据对转录组微阵列进行了荟萃分析，得出PI3K、AKT及mTOR反应在Ⅲ-Ⅳ期子宫内膜异位症中富集。Yan等[10]研究结果表明，抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路可缓解坐骨神经异位症疼痛,可能成为潜在的靶向机制。

随着中医的发展，治疗EMs的方法逐渐增多。其中针灸疗法被广泛认可，针灸属于中医学的一种，对疼痛类疾病，能起到良好的镇痛作用，可畅达气机推动气血运行，提高机体免疫力[11]。杨兆钢主任经过长期临床实践，运用芒针以秩边穴深透水道穴为主治疗前列腺炎症，发挥了芒针的优势[12]。随后冀来喜教授根据其经验提出“秩边透水道”针法，将其操作规范化以及干预慢性前列腺炎效果进行了研究，也取得卓效[13]。现阶段本课题组通过临床和实验研究，体现了“秩边透水道”针法治疗痛经、压力性尿失禁和少弱精症等疾病的确切疗效[14-16]。前期课题研究亦表明“秩边透水道”针法通过上调大鼠子宫内膜组织内Beclin-1、LC3的表达促进自噬来改善EMs[17]。在此基础上，本实验进一步观察“秩边透水道”针法对EMs大鼠PI3K/Akt/mTOR信号通路及血清CA125、EMAb及VEGF的影响，探讨针刺治疗EMs的作用机制，这些可能在未来具有治疗意义和临床适用性。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选取45只SD大鼠，8周龄，体质量(180±20)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证编号为SCXK(京)2016-0006，条件：明暗周期为10/14 h，温度22～26 ℃，湿度40%～70%。动物研究批号：2019DW300。成型饲料和标准水喂养1周后，随机法分为假手术组、模型组、针刺组、激动剂组与针刺加抑制剂组，每组9只。

1.2 主要试剂与仪器

一次性毫针0.25 mm×15 mm；雷帕霉素(美国MCE,HY-10219);3-甲基腺嘌呤(美国MCE,HY-19312)；透射电子显微镜(hitachi货号HT7700)；RIPA裂解液(Servicebio,货号G2002)；电镜固定液(Servicebio,货号G1102)；子宫内膜抗体EMAb、卵巢癌标志物CA125和血管内皮生长因子VEGF试剂盒(购自杭州吉泰和宁，货号CK-E34930、CK-E30615和CK-E30908)；酶标分析仪(Rayto RT-6100)；mTOR抗体(servicebio,货号GB11405)；PI3K抗体(BIOSS,货号BSM-33219M)；AKT抗体(servicebio,货号GB111114)；台式高速冷冻离心机(DRAGONLAB货号D3024R)；微量高速离心机(TG16W,长沙湘智离心机仪器有限公司,型号TG16W)；电子天平(上海良平,规格：1.120 g/0.1 mg,型号AE1204m)；电子分析天平(瑞士PRECISA XB220A)。

1.3 模型制备

参考琼斯的造模方法造模[18]:选取45只大鼠,术前各组大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇(0.1 mg/kg),禁食不禁饮1 d,腹腔麻醉,固定于鼠板上,去毛,在尿道口上方约1 cm处行3 cm左右的垂直正中纵切口进入腹腔,在膀胱下方可见子宫呈“Y”形。近端在离宫角约1 cm处结扎,远端在离卵巢约2 cm处结扎,取中段子宫放入青霉素缓冲液中洗涤,随后切开管形子宫,剥离浆膜层、肌层,将剥离的子宫内膜剪为5 mm×5 mm大小的片段,将内膜层对着种植部位，植入36只受体大鼠左右两侧的腹壁处,最后关腹。假手术组单纯开腹。

术后连续3 d肌肉注射青霉素0.1 mL，防止感染。先给予水后投喂食物，以防发生肠梗阻。同时检查伤口开裂情况，进行缝补。评估标准：造模后常规喂养15 d，再次开腹,观察发现子宫内膜异位灶呈囊性增长和扩大，囊壁内产生新鲜血管，囊泡内有明亮或呈黄色液体[19]。卡尺测量移植物体积v=0.52×长×宽×高(v>25 mm3)。

1.4 干预方法

假手术组、模型组大鼠只进行捆绑，针刺组造模成功2周后，先捆绑，穴位消毒，选取秩边穴：臀外下部，股骨大转子与尾椎结合部连线外1/3与中1/3交点处[20-21]，顺着同侧水道穴方向进针，深度13 mm左右，待针下有紧实感，进行提插捻转，留针20 min。激动剂组腹腔注射激动剂雷帕霉素，剂量为50 μmoL/L，2 mg(kg·d)；针刺加抑制剂组针刺后腹腔注射抑制剂3-甲基腺嘌呤，剂量为400 nmoL/μL，1.5 mg(kg·d)。各组1周干预6次,共3周。

1.5 标本采集

1.5.1 腹腔采血 干预3周后，大鼠禁食24 h，正常饮水，腹腔麻醉，肉眼观察大鼠没有活动后，指掐尾部，无反应，且全身变软。把大鼠置于手术台上，腹部消毒，提起腹部皮毛，沿腹中线剪开，充分暴露腹部脏器，两手持棉球将覆盖在血管上边的肠道与血管周围的脂肪扒开，置于一旁，找到腹主动脉(比较粗)，左手将大鼠背部垫起，便于看清腹主动脉以及进针，右手持穿刺针，进针角度15°～30°，平刺，避免血管弯曲，采血5 mL，拔出针头，用棉球按压针孔。3 000 r/min离心10 min(离心半径12 cm)取上清，分装成50 μL/管，-20 ℃冷冻，使用时在室温下解冻。严格按照说明书操作。

1.5.2 子宫内膜组织病理形态观察 干预3周后，取大鼠异位内膜，切成0.5 cm×0.3 cm×0.1 cm小块。4%多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，5 μm厚度连续切片，HE和甲苯胺蓝染色后，行光镜查看内膜组织形态。

1.5.3 透射电镜检测自噬小体 取新鲜内膜组织置于电镜固定液4 ℃固定2～4 h。用0.1 M磷酸盐缓冲液冲洗，锇酸再次固定2 h，依次脱水，渗透5～8 h，包埋，将组织切成60～80 nm的超薄切片，染色，进行观察。

1.5.4 内膜组织PI3K、AKT及mTOR蛋白的表达检测 用预冷的PBS将组织块洗涤干净，剪成小块匀浆,12 000 r/min离心10 min，提取总蛋白。测定蛋白浓度，蛋白变性，SDS-PAGE电泳后转膜。进行免疫反应，一抗稀释比(PI3K、AKT：1∶1 000；mTOR：1∶250)将二抗用TBST按照1∶5 000的比例进行稀释，孵育，加入TBST快速洗脱3次。化学发光，用Alpha软件分析目标带的光密度值。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 EMs大鼠模型评价

建模15 d后，观察异位灶生长情况，发现异位灶体积变大，附着新鲜血管，内有明亮的液体聚集。见图1。与治疗前比较，治疗后各组体积缩小，差异具有统计学意义(P<0.01)；模型组异位病灶体积增大，差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，各治疗组异位病灶体积明显缩小，差异具有统计学意义(P<0.01)；针刺组体积明显低于针刺加抑制剂组，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 各组EMs大鼠异位灶体积变化

2.2 各组大鼠内膜组织形态学比较

HE染色结果显示，假手术组子宫内膜上皮细胞完整，腺体间质正常生长，未见异常改变；模型组异位内膜大量上皮细胞不完整，肌层肌纤维排列不规则，内部间隙增宽，血管增多；针刺组异位内膜上皮可见少量脱落的矮立状细胞，排列规则，血管数量减少；激动剂组异位内膜可见少量上皮细胞及子宫腺上皮细胞坏死，可见少量炎性细胞浸润，血液流动不明显；针刺加抑制剂组异位内膜少量上皮细胞完整，肌纤维排列略整齐，间质可见炎性细胞浸润，可见血管内积聚较多血液。见图2。

图1 造模过程及模型大鼠异位灶

注：A假手术组；B模型组；C针刺组；D激动剂组；E针刺加抑制剂组(假手术组取在位内膜，其余组取异位内膜)。图2 各组大鼠内膜组织形态学比较(100×)

2.3 各组大鼠内膜细胞自噬体超微结构的变化

假手术组细胞结构尚可，核膜完整，核周隙正常，微绒毛、线粒体丰富，粗面内质网表面可见核糖体附着，相对多的自噬小体、自噬溶酶体；模型组微绒毛稀疏，线粒体肿胀严重者膜破损，基质外溢,粗面内质网明显扩张，自噬小体个别存在；针刺组细胞间可见紧密连接及少量桥粒，线粒体、粗面内质网结构尚可，较多的自噬小体、自噬溶酶体；激动剂组微绒毛局部稀疏，粗面内质网部分脱颗粒、空泡变，较少的自噬小体、自噬溶酶体；针刺加抑制剂组线粒体中度肿胀者，膜内基质变淡，嵴减少、消失，粗面内质网大多扩张，偏少的自噬小体。见图3。

2.4 各组大鼠血清中EMAb、CA125及VEGF的含量变化

模型组血清中EMAb、CA125及VEGF水平明显高于假手术组(P<0.01)；治疗后3组血清中EMAb、CA125及VEGF水平明显低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.01)；针刺组与激动剂组血清中EMAb、CA125及VEGF水平差异无统计学意义(P>0.05)；与针刺加抑制剂组比较，针刺组与激动剂组血清中EMAb、VEGF和CA125水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。表明治疗后血清各指标水平均降低，以针刺组效果最为突出。见表2。

注:A假手术组；B模型组；C针刺组；D激动剂组；E针刺加抑制剂组(假手术组取在位内膜，其余组取异位内膜)。微绒毛(Mv)，细胞核(N)，线粒体(M)，粗面内质网(RER)，自噬小体(AP)，自噬溶酶体(ASS)。图3 各组大鼠内膜细胞自噬体超微结构的比较(2k×)

表2 各组大鼠血清中EMAb、CA125及VEGF的含量变化

2.5 各组大鼠内膜组织中PI3K、AKT及mTOR蛋白表达

模型组内膜组织中PI3K、AKT及mTOR水平显著高于假手术组，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比,治疗后3组内膜组织中PI3K、AKT及mTOR水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01)；针刺组与激动剂组内膜组织中PI3K、AKT及mTOR表达水平无统计学意义(P>0.05)；与针刺加抑制剂组比较，针刺组内膜组织中PI3K、AKT及mTOR水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01)，激动剂组内膜组织中PI3K、AKT及mTOR表达水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。综上所述，各治疗组治疗后可以抑制PI3K/Akt/mTOR蛋白的表达，针刺组效果最为显著，见表3、表4和图4。

表3 各组大鼠在位内膜组织中PI3K、AKT、mTOR蛋白的表达

表4 各组大鼠异位内膜组织中PI3K、AKT、mTOR蛋白的表达

注：A假手术组；B模型组在位内膜；C模型组异位内膜；D针刺组在位内膜；E针刺组异位内膜；F激动组在位内膜；G激动组异位内膜；H针刺加抑制组在位内膜；I针刺加抑制组异位内膜。图4 大鼠内膜组织PI3K、AKT及mTOR蛋白表达电泳

3 讨论

子宫内膜异位症发生的病灶部位很多,比如盆腔、膀胱等,但好发于盆腔。EMs的病机,黄飞翔对其进行归纳,将内异症的中医病机修订为血瘀证[22],即“瘀血阻滞胞宫、冲任”[23]。改善患者所经历的痛苦症状、改善生育力和为异位症女性开发非手术治疗方法是临床医生和研究人员的共同愿望。目前常用的是手术和激素类药物治疗,术后大多数女性患者生育时无法承受分娩过程中出现的疼痛。对于异位症恶变发生在卵巢以外的患者，要慎重应用雌激素。长期服用身体可出现不良反应[24]。手术和药物治疗EMs复发率高[25]。因此需要开发新的、有效的和安全的针对特定分子和信号通路的治疗方法。有学者阐述了同类针法治疗异位症体现针灸的镇痛和活血化瘀功能[26]。“秩边透水道”针法从长针到芒针再到毫针一步步演变，应用时间较长，已成为稳定的针法。其可以缓解疼痛，还能够改善子宫血液流变学[14]。因此，本实验通过针刺干预EMs模型大鼠，探讨该针法对EMs大鼠的作用机制。

兴奋PI3K/AKT/mTOR信号通路可以促进细胞增殖[27]，Liu等[28]验证了激活PI3K/AKT/mTOR信号通路可能使子宫内膜癌(EC)更加严重，重点是PI3K通路作为自噬的开始[29]，在自噬功能中承担着重要的作用。mTOR作为PI3K/AKT信号通路的下游效应器，经PI3K与AKT在细胞膜上相互作用，磷酸化后间接活化，抑制自噬。运用雷帕霉素抑制mTOR活性，可以诱导自噬，而自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤作用于PI3K-Ⅲ从而直接抑制自噬起始[30]。林琼燕等[31]提出在EC中，顺铂抗肿瘤可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路调节自噬达到治疗目的。然而，尚不确定“秩边透水道”针法是否影响PI3K/AKT/mTOR信号通路。前期研究指出运用“秩边透水道”针法刺激大鼠，该子宫内膜组织中自噬Beclin1和LC3水平上升，自噬活性增强，以此治疗EMs。本实验电镜结果显示各组大鼠内膜细胞中都存在自噬小体，但针刺组相对较多。推测PI3K/AKT/mTOR信号通路作为自噬上游通路，可能针刺抑制此通路提高大鼠体内子宫内膜细胞自噬能力从而使EMs的症状发生改变。

VEGF，又叫做VEGF-A,本身是一个蛋白质，在家族成员中有“领导”身份，可以调节血管生成和介导疾病[32]。多种疾病的发生和发展及治疗，经常将VEGF作为检测因子来研究，比如：EMs、慢性偏头痛[33-34]。VEGF也受到多种途径的调控，其中研究最多的通路之一包括PI3K/AKT/mTOR信号通路，其调节VEGF的表达，剥夺新生血管的生存优势，减少形成，从而预防EMs[35]。在本研究中，模型组血清中VEGF、在位以及异位内膜组织中PI3K、AKT和mTOR蛋白升高，提示PI3K/AKT/mTOR信号通路参与了异位症相关血管生成的发病机制。经干预后，血清中VEGF、在位以及异位内膜组织中PI3K、AKT及mTOR蛋白降低，逆转了变化。其中针刺组和激动剂组的治疗作用相当，都可降低PI3K、AKT、mTOR蛋白以及VEGF水平，可能是“秩边透水道”针法与雷帕霉素均可以抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，促进自噬。经针刺加抑制剂干预后，自噬通路PI3K、AKT、mTOR蛋白以及血清水平明显升高,说明自噬抑制剂抑制PI3K-Ⅲ从而抑制自噬，与“秩边透水道”针法抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导自噬的作用相反，削弱了“秩边透水道”针法的功效。另外，经干预后，HE染色结果显示治疗后各组异位内膜的上皮细胞趋于完整、血管数量减少以及血流速度减缓和炎性细胞减少的程度不同，针刺组和激动剂组治疗变化明显优于针刺加抑制剂组。进而表明“秩边透水道针法”通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号转导级联，减少血管形成，防止异位灶生长，发挥治疗EMs的效应。

实验中EMAb和CA125发生了明显的变化。EMAb是一种抗子宫内膜抗体，是诊断EMs常用的生物标志物。EMs患者受到异位内膜的刺激，EMAb增多[35]。陈琼华等[36]研究得出EMs患者中EMAb的非阴性率可达70%～80%。CA125作为肿瘤标志物，用于检测上皮性卵巢癌[37]。王莹等[38]研究发现EMs患者血清中CA125浓度上升，提示较高的CA125水平在EMs的诊断、疗效评估、疾病复发和鉴别等方面有重要意义。胡海雷等[39]研究发现内异症患者血清中VEGF、CA125水平伴随EMAb水平增加，客观反映了血管新生的旺盛，说明EMAb在评价异位症病情严重程度的重要性。刘增娟团队[40]发现联合检验血清中EMAb、CA125优于单一检验。结合检测可以作为一种有效的无创筛查方法。本研究发现，模型组血清中EMAb、CA125水平成高表达，推测两个标志物间接因腹膜刺激而升高，结果与文献报道一致。经治疗后，各组大鼠血清中EMAb、CA125水平不同程度地降低。针刺组和激动剂组优于针刺加抑制剂组，可能是针刺对机体调整作用的结果，抑制两个标志物的分泌，减轻EMs的症状，而抑制剂可能影响了针刺抑制肿瘤物分泌的作用。预实验中在治疗前对EMs大鼠眼内眦采血，可能是因为疼痛大鼠在后续实验中灵活度减弱；经大腿股动脉采血，采集的血量较少；经尾静脉采血，采血量只有1～2滴且容易发生感染。考虑到EMs大鼠的存活量以及血清指标治疗前后对比需要是同一个体，而腹腔采血会导致大鼠死亡，所以未对治疗前的EMs大鼠进行腹腔采血。正式实验没有将EMs大鼠血清中EMAb、CA125及VEGF水平的治疗前后进行对比。

本研究中，笔者首次表明针刺可能阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路，增加子宫内膜自噬,还可降低血清中EMAb、CA125及VEGF水平，从而起到治疗EMs 的作用,可能是一种有效的方法以及新的见解。同时，还需要进行更多的研究深入探讨PI3K/AKT/mTOR通路在下丘脑的调控作用以及相关激素因子的检测，加以说明其作用机制，从而成为异位症治疗的可行策略。