温针疗法联合豨莶草对风湿性关节炎大鼠滑膜细胞活性及SphK1/S1P/S1PR1信号的影响

文培培,高 宇,王晓云,刘益兵,池红万

(郑州市骨科医院，河南 郑州 450052)

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)属于慢性、系统性及免疫性疾病，病理特征是滑膜组织存在慢性炎性增生可导致不可逆的软骨损伤[1]。全球范围内RA发病率较高，发病人群为女性多发，致残率可高达20%，严重威胁患者身心健康[2]。到目前为止，RA的发病原因尚不清楚，但认为与免疫系统、感染等多种复杂原因相关。相关研究表示，滑膜细胞异常增殖是RA病发过程的主要原因，因滑膜细胞存在与肿瘤细胞相似特性可释放大量炎性因子致滑膜组织增生肥大并促使VEGF表达增加血管翳形成进一步加重病情[3]。近年相关研究表示，RA发生发展与多种信号通路异常相关，1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine 1-phosphate,S1P)在RA中异常表达，可作为细胞内信号传导信使作用于不同蛋白而发挥细胞活性调节作用[4]。鞘氨醇激酶1(Sphingosine kinase 1，SphK1)是在哺乳动物中被发现的鞘氨醇激酶,能够通过磷酸化Sp生成S1P，促进肿瘤细胞存活及增殖[5]。在RA疾病中已经证实SphK1/S1P/S1PR1信号通路表达激活发挥促炎作用。

针灸治疗RA历史悠久，针灸治疗方法具有多样性，例如蜂针、温针与电热灸等。在RA中温针具有疏经通络、散寒利湿等作用，已经证实能够改善RA疾病并受到医学界广泛认可[6]。豨莶草属于草本植物，主要生长在我国东北及华北，具有祛风湿、通经络与清热解毒等功效，常被用来治疗风湿麻痹、肢体麻木及中风等疾病[7]。目前针灸联合中药成为医学界治疗RA的研究热点，本研究基于此观察温针疗法联合豨莶草对RA大鼠滑膜细胞活性及SphK1/S1P/S1PR1信号的影响，为RA治疗提供新的治疗方法。

1 材料与方法

1.1 实验大鼠

SPF级SD雌性大鼠，鼠龄6周，共50只均选自浙江维通利华实验动物技术有限公司，体质量200～300 g，许可证号：SCXK(浙)2019-000l，湿度为55%，温度25 ℃，模拟黑白交替无菌饮食2周，定时清洗、消毒鼠笼，实验要求符合《实验动物管理条例》规定管理规定。本实验严格按照科技部[(2006)398号]《关于善待实验动物的指导性意见》文件要求进行实验。

1.2 药物、试剂与仪器

豨莶草药材饮片(亳州市仁惠堂中药材销售有限公司，批号：190807)，样品经本省药品监督检验研究院主任药师鉴定为菊科植物豨莶草(HerbaSiegesbec-kiae)；试剂：弗氏不完全佐剂(北京伊塔生物科技有限公司，F5506)；SPHK1单抗(卡梅德生物，KMPH5200);S1PR1单抗(艾美捷科技有限公司 ，QrPrEST23593)；ERK1/2抗体(上海雅吉生物科技有限公司 ，s-0022R)；DMEM高糖培养基(上海联硕宝为生物科技有限公司，FB8025)；胎牛血清[爱必信(上海)生物科技有限公司]；0.25%胰蛋白酶(上海信裕生物科技有限公司，XY6020)；噻唑蓝MTT试剂(北京索莱宝科技有限公司，M8180-1)，二甲基亚砜(DMSO)(北京德航五洲科技有限公司 ，MB1315T)；0.30 mm×15 mm华佗牌毫针(河南省安邦卫材有限公司，00056)；DB022型足趾容积测量仪(北京智鼠多宝生物科技有限责任公司，1545125)；蛋白电泳仪(北京六一，DYY-7C)。

1.3 豨莶草提取物的制备

将豨莶草药材干燥后粉碎，在1 kg的药物中加入8 L 95%浓度的医用酒精过夜，加热回流2次，采用等体积的80%的医用酒精提取药物残渣，经过滤、浓缩、水浴及蒸干后得到总提取物212 g，0.5%羧甲基纤维素钠水溶液稀释至所需浓度。

1.4 RA模型建立

RA模型建立参考文献[6]，取2 mg的牛Ⅱ型胶原溶于2 mg的0.5 mol/L乙酸中，4 ℃下静置24 h溶化，再取相同剂量的弗氏不完全佐剂冰浴下制成乳化剂。大鼠腹腔注射0.3 mL/100 g浓度为10%的戊巴比妥钠麻醉后，取0.1 mL的上述乳化剂在大鼠足底部位皮下接种，1次/d，连续21 d。建模后大鼠足部明显红肿、体积增大，表明建模成功。

1.5 分组及干预方法

将50只大鼠按照随机数字法分为正常组、RA组、温针组、药物组及联合组，各10只。除正常组外其余大鼠均建立RA大鼠模型。建模成功后，温针组大鼠进行温针治疗：固定大鼠穿自制鼠衣，穴位参考中国针灸学会实验针灸研究会制定的“实验动物针灸穴位图谱”，穴位包含足三里、肾盂与悬钟,采用0.30 mm×15 mm的毫针针刺上述部位，深度约为5 mm，强度以大鼠耐受为度，采用香烟型纯艾条在距离的2 cm处进行悬灸。1次/d，1次5min，连续治疗21 d。药物组灌胃1.6 g·kg-1的豨莶草提取物，每次灌胃1次，连续21 d。联合组温针治疗后灌胃豨莶草提取物，其余组灌胃同体积的生理盐水。

1.6 大鼠足部体积检测

干预后14 d、18 d及21 d采用排水法检测各组大鼠足部体积，具体方法：将大鼠足部插入灌满水的特制量筒中，保持水面与膝关节上2 cm持平，从量筒侧口接排出的水，水的体积则为所测大鼠足跖部的体积。每只大鼠每次分别测量3次，取其均值。

1.7 HE染色观察滑膜组织病理形态

上述实验完成后，选用2%的戊巴比妥钠腹腔麻醉处死大鼠，取左足跖关节组织石蜡包埋，10%的甲醛溶液中，固定过夜，自来水冲洗，浸泡于14%的EDTA溶液中脱钙，逐层脱水与石蜡包埋后4 μm切片后备用。各组大鼠牙髓组织切片放入37 ℃复温15 min，二甲苯脱蜡后按照100%-95%-85%及75%乙醇进行逐层脱水，苏木精染色10 min，盐酸(1%)处理，伊红复染，100%-95%-85%及75%乙醇脱水，封片后观察组织形态。

1.8 滑膜细胞分离提取

提取各组大鼠滑膜组织，去除脂肪及纤维组织，在含有100 KU/L的青霉素及100 mg/L的链霉素的D-Hanks液冲洗3次，后剪碎1～3 mm3的小块，加入浓度为2%的4 mL的Ⅱ型胶原酶DMEM培养液中，在37 ℃、5%的CO2培养箱中培养2 h后，将未贴壁的细胞移至离心管中，按1 500 r/min，离心15 min，弃上清加入0.25%的胰蛋白酶40 mL消化10 min，再次离心，加入D-Hanks液制成单细胞悬液进行计数。

1.9 MTT法检测各组滑膜细胞存活率

6孔板中每孔均加入150 μL滑膜细胞悬液，数目5×103，每组设置6孔，加入MTT(5 g·L-1)，每孔20 μL，遮光条件下加入200 μL的DMSO溶液，轻微摇晃15 min后促使充分溶解后，在24 h、48 h、72 h及96 h时应用波长490 nm检测吸光度(OD值)。

1.9.1 Hoechst检测各组滑膜细胞凋亡率 用24孔板培养各组细胞，滑膜细胞数目分别为1×105，采用40 g/L的多聚甲醛固定0.5 h，采用TrintonX-100透明处理，加入浓度为5 mg/L的Hoechst荧光材料染色，在细胞培养箱中孵育30 min，荧光显微镜观察到凋亡细胞呈现颗粒荧光，未凋亡呈现低密度荧光，随机拍照选择5个高倍镜视野，应用ImageJ1.47i软件计算平均荧光强度，实验重复5次，凋亡率=凋亡细胞/细胞总数×100%。

1.9.2 免疫印迹检测各组滑膜细胞SPHK1、S1PR1及ERK1/2蛋白表达 各组滑膜细胞移入孔6板中，细胞浓度为2.5×104个mL，PBS冲洗，加入150 μL RIPA的裂解液，12 000 r/min离心15 min后，放入样孔中，进行电泳实验。PVDF膜TBS浸泡10 min，反复PBS冲洗，5 min/次，加入SPHK1(1∶1 000)及S1PR1(1∶1 000)及ERK1/2(1∶1 000)和内参GAPDH抗体(1∶2 000)，TBS冲洗3次后，加入辣根过氧化酶标记的山羊抗兔(1∶5 000)，杂交冲洗。后将膜浸入ECL工作液，随后进行检测，获取图像。

1.10 统计学处理

采用SPSS23.0软件对本研究数据进行分析，各组数据服从正态分布，计量数据采用均数±标准差描述，多组间比较采用方差分析，事后检验采用Bonferroni法进行组间两两比较，统计学检验设定的水准为0.05，P<0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠足部体积比较

与正常组比较，RA大鼠治疗14 d、18 d及21 d的足部体积均升高(P<0.05)，与RA组比较，温针组、药物组及联合组大鼠治疗14 d、18 d及21 d的足部体积均降低(P<0.05)，与温针组、药物组比较，联合组大鼠足部体积降低(P<0.05)，其余自制差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 各组大鼠关节病理组织形态比较

正常组大鼠踝关节面光滑、滑膜完整、无炎症浸润及水肿;RA组大鼠踝关节炎性细胞浸润严重，滑膜组织增厚，关节腔隙狭窄及软骨破坏;温针组及药物组大鼠踝关节炎性浸润减少，滑膜增生降低;与药物组相比，联合组大鼠踝关节滑膜厚度未见增厚,炎性细胞浸润减少。见图1。

表1 各组大鼠足部体积比较

图1 各组大鼠关节病理组织形态比较(200×)

2.3 滑膜细胞生长

滑膜组织中分离的滑膜细胞在24 h时细胞的分布较为稀疏，呈现细纺锤形生长，48 h时细胞间细长的突起相连并交织成网状排列，单层生长，细胞核明显，可进行传代。见图2。

图2 24 h及48 h滑膜细胞生长(200×)

2.4 MTT法检测各组滑膜细胞存活

MTT结果显示：与正常组比较，RA组24 h、48 h、72 h及96 h的滑膜细胞OD值升高(P<0.05);与RA组比较，温针组24 h、48 h、72 h及96 h的滑膜细胞OD值均降低(P<0.05);与温针组比较，联合组细胞OD值明显较低(P<0.05);其余组别差异无统计学意义(P>0.05)。

组内不同时间相比，正常组的24 h、48 h、72 h及96 h的滑膜细胞株存OD值差异均无统计学意义(P>0.05)，其余组别滑膜细胞OD值随着时间延长而不断升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组滑膜细胞24 h、48 h、72 h及96 h细胞OD值比较

2.5 各组滑膜细胞凋亡率比较

正常组、RA组、温针组、药物组及联合组的滑膜细胞凋亡率分别为(2.54±0.60)%、(2.88±0.55)%、(12.55±1.47)%、(13.03±1.32)%及(20.14±3.05)%，组间比较差异有统计学意义(F=202.400，P<0.001)。进一步两两比较，与RA组比较，温针组滑膜细胞凋亡率升高(P<0.05);与温针组、药物组比较，联合组凋亡率升高(P<0.05);其余组别差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

2.6 各组滑膜细胞SPHK1、S1PR1及ERK1/2蛋白水平比较

与正常组比较，RA组SPHK1、S1PR1及ERK1/2蛋白升高(P<0.05);与RA组比较，温针组SPHK1、S1PR1及ERK1/2蛋白均降低(P<0.05);与温针组、药物组比较，联合组SPHK1、S1PR1及ERK1/2蛋白更低(P<0.05);其余组别差异无统计学意义(P>0.05)。见表3、图4。

图3 各组大鼠滑膜细胞凋亡比较(200×)

图4 各组滑膜细胞SPHK1、S1PR1及ERK1/2蛋白比较

表3 各组滑膜细胞SPHK1、S1PR1及ERK1/2蛋白水平比较

3 讨论

类风湿性关节炎(RA)是一种类属于骨科和风湿免疫科的关节疾病。研究显示，患有类风湿性关节炎病程较久的患者会出现神经系统或内脏损伤等问题[8]。类风湿性关节炎在临床上普遍具有病程较长、迁延不愈的特点，且目前并未实现对类风湿性关节炎彻底攻克，患者致残率极高，对患者自身、家庭带来了沉重的心理负担和经济负担。对RA的治疗临床以药物为主，且温针是我国传统治疗方式之一，经络与五脏六腑之间关联密切，经大量学者证实温针能够发挥改善RA疾病[9]。本研究通过将温针联合豨莶草证实能够抑制滑膜细胞活性而发挥改善作用,主要与抑制SPHK1、S1PR1及ERK1/2活性相关。

本研究证实，联合组大鼠干预14 d、18 d及21 d时的足部体积均降低，HE染色结果证实，能够抑制滑膜组织增厚改善关节组织紊乱，说明温针联合豨莶草对RA发挥抗炎修复作用。大鼠建立RA模型后经过Ⅱ型胶原诱导以及寒冷刺激后，大鼠的踝关节组织细胞层变厚，白细胞和淋巴细胞等大量充斥于视野，维持细胞间的绒毛减少，细胞间的连续性减弱，提示细胞炎性状态明显增加而导致足部体积增加[10]。目前RA的治疗西药有甲氨蝶呤、萘普生等能够抑制关节症状，但是西药毒性作用较大,因而采用中医治疗成为研究热点。RA在中国属于“尪痹”“痹证”等范畴，病因与脾胃虚弱、阳气不足、卫外无力和风寒湿火等因素相关[11]。豨莶草作为我国的传统中药，按照现代药理学研究具有抗炎镇痛、改善心脑血管损伤及心血管保护作用。已经被证实能够发挥抗风湿性关节炎、腰间盘突出等疾病作用。豨莶草能够降低RA大鼠足部体积，通过作用抑制炎性因子表达而改善骨关节破坏，从而降低大鼠足部体积[12]。RA的产生与邪气内存、脾胃虚弱及气血不足等相关，可采用温针治疗，达到补肾益气、温经通络除湿和标本兼治等作用[13]。温针疗法作为我国传统医学的经典外治法之一，集针刺穴位、温热和药物刺激等于一体，与单纯电针疗法不同，除具备行气、疏经通络作用外，还有温通经脉、祛湿温寒和去结镇痛之功。温针疗法刺激穴位使得经气运行、经络疏通，再借助艾灸的热力给予温热性刺激，经络腧穴及温热效应相结合，更好达到温通血脉、行气活血止痛的功效，例如《灵枢·刺节真邪》曰：“脉中之血，凝而留之，弗之火调，弗能取之。”是指脉中血气凝滞，无法运行周身，只能用火法驱寒，调顺血脉。温针针刺能够发挥调节脾胃、通畅气机和通经活络等作用,温针针刺肾俞能够发挥强腰健骨作用，温针针刺悬钟仍是胆经之穴,主骨所生病。穴位配合共奏补益功效达到正胜邪退之目的，改善症状[14-15]。

滑膜细胞增殖在RA发生发展中具有关键作用，本研究表明联合组大鼠滑膜细胞增殖降低，说明温针及豨莶草具有抑制滑膜细胞活性作用,可能机制与抑制SPHK1、S1PR1及ERK1/2活性相关。在RA关节损伤后滑膜细胞可参与多种信号通路及对关节软骨和周围骨组织的损害，还可分泌多种细胞炎性因子而形成错综复杂的网络，参与了RA病理生理过程[16]。S1P属于细胞内部第二信使，能够发挥细胞活性调节作用。S1P的主要合成酶类为SphKs，包含SphK1和SphK2，SphK1具有抑制细胞凋亡及加快其存在作用[17]。在自身病理状态下，SphK1可产生大量炎性因子，并可激活ERK1/2作用同时提高SphK14倍活性而增加滑膜细胞活性。S1PR1可随着滑膜细胞增殖而表达升高，当减少S1PR1表达可进一步抑制S1P下游通路ERK1/2表达发挥抑制炎症作用[18]。通过体外大鼠实验证实，RA大鼠中炎症因子可促进ERK1/2表达进一步激活SphK1表达而增加S1P生成，并当采用Erkl/2抑制剂SCH772984后SPHK1、S1PR1及ERK1/2活性均降低，说明调节上述信号通路可抑制炎症表达同时可减少滑膜细胞增殖。豨莶草提取物可通过抑制炎性细胞浸润而减少滑膜细胞增生，表示改善炎症细胞因子方式与抑制TRL4激活相关[19]。本研究结果证实，豨莶草可发挥抗炎作用,能够恢复抗炎信号通路活性而显著抑制SPHK1、S1PR1及ERK1/2表达，提示其与抑制滑膜细胞活性相关。艾叶气味芳香易燃，发挥温经通路、行气活血及驱寒除湿作用，通过热感渗透到皮肉筋骨之中，配合针刺疗法而增加血流流速及血管扩张等作用，能够加快关节新陈代谢。李琳琳[20]研究表示，消痹汤联合温针灸可以提高类风湿性关节炎患者免疫功能,减轻其疼痛症状。本研究证实温针能够抑制SPHK1、S1PR1及ERK1/2表达而发挥抗滑膜细胞活性作用，研究机制可能在于温针能够散寒理气、通经活络而发挥抗炎作用,与抑制ERK1/2激活和抑制SPHK1、S1PR1活性相关。

本研究受成本限制，未添加更多组别，实验结果可能存在不足，后期本课题组会加强和其他相关研究单位合作，增加样本量，细化实验内容，为RA的临床治疗提供参考依据。综上所述,风湿性关节炎大鼠采用温针疗法联合豨莶草干预可抑制滑膜细胞活性，改善大鼠足部体积，这可能与抑制SphK1/S1P/S1PR1信号转导相关。