不同热处理方式脱除草莓植株体内草莓轻型黄边病毒的研究

刘羽丰 闫哲 王志 封林林 于翠 任俊达* 尚巧霞*

（1 北京农学院生物与资源环境学院，农业农村部华北都市农业重点实验室，北京 102206；2 北京开心格林农业科技有限公司，北京 102200）

草莓（Fragaria ananassaDuch.）营养价值丰富，富含维生素、有机酸、矿物质等营养成分（杨波 等，2018）。目前草莓栽培主要通过匍匐茎进行繁殖，导致病毒世代传播（Jana et al.，2019）。草莓病毒病症状表现为植株变色、畸形、矮化、根系弱，直接降低果实的品质和产量（Bonneau et al.，2019）。草莓轻型黄边病毒（strawberry mild yellow edge virus，SMYEV）、草莓镶脉病毒（strawberry vein banding virus，SVBV）、草莓斑驳病毒（strawberry mottle virus，SMoV）、草莓皱缩病毒（strawberry crinkle virus，SCV）和黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）是影响草莓生产的常见病毒（陈柳 等，2015；尚巧霞，2015；王佳 等，2020）。病毒单独侵染时，草莓植株往往无明显症状，单独侵染率为33.7%，草莓果实减产30%；而复合侵染时草莓植株常表现变色、畸形等典型症状，复合侵染率仅为7.2%，但减产可高达99%（刘雅 等，2021；王佳 等，2021）。目前病毒病是制约草莓产量和品质的重要因素。

使用脱毒种苗是控制草莓病毒病最有效的措施。与带毒苗相比，脱毒种苗在田间生长势更好，叶片、匍匐茎和花更多；还能通过影响根系生长提高养分利用率（Quiroz et al.，2017；Yang et al.，2022）。草莓病毒脱除通常采用茎尖培养法、热处理法、超低温处理法等（孙崇波 等，2008；盛宏亚 等，2016）。切取长度小于0.3 mm 的草莓茎尖进行培养，红颜脱毒率达到93%以上；大于0.5 mm 则无法保证脱毒效果（杨肖芳 等，2015；邓渊，2018）。经超低温处理，红颜脱毒率可达100%，但茎尖成活率不高（罗娅 等，2016）。热处理是脱除草莓植株体内病毒的有效途径。在热处理前进行预培养会提高处理植物的存活率（Hu et al.，2018）。逐步升温至38 ℃培养组培苗30 d，切取长度为0.3～0.5 mm 茎尖进行培养，红颜组培苗脱毒率为100%，但存活率不到30%（陈英 等，2017；聂园军 等，2019）。草莓种苗脱毒处理除了要保证脱毒率外，还应注重组培苗的存活率，因此深入研究热处理脱毒方法的处理温度和处理时间在草莓脱毒种苗的生产中显得格外重要。

病毒检测是脱毒效果评价的重要环节，主要检测方法包括指示植物法、酶联免疫吸附测定法（ELISA）和分子生物学检测法等。指示植物法检测周期长（尚巧霞，2015），ELISA 易出现假阳性反应（王佳，2021），皆存在局限性，目前在草莓病毒检测中应用较少。分子生物学检测法主要包括RT-PCR、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、环介导等温扩增技术（LAMP）和高通量测序技术等（Ding et al.，2019；Dullemans et al.，2020；Ren et al.，2021），具有灵敏度高、检测速度快等优点。

本试验采用不同热处理方式对北京地区红颜草莓组培苗进行病毒脱除，并利用RT-PCR 和RTqPCR 检测病毒的脱除率，以期通过简单、快捷的方式获得脱毒苗，保障草莓脱毒种苗的生产。

1 材料与方法

1.1 试验材料

草莓组培苗为2014—2022 年于北京地区收集的市售品种红颜，草莓匍匐茎为2021 年于北京地区草莓农业园采集的红颜。

1.2 试验方法

1.2.1 茎尖组织培养 将采集到的生长健壮的草莓匍匐茎带回北京农学院植物病理实验室，剥去外层苞片，用流动自来水冲洗1 h，75%乙醇浸泡30 s，4%次氯酸钠消毒6 min，无菌水冲洗4 次，吸水纸吸干。无菌环境中，在双筒解剖镜下采用直尺测量快速切取长度为0.3 mm 的茎尖，接种至初代培养基（MS+6-BA 1 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+PVP 1 g ·L-1）中。30 d 后将萌发的不定芽接至继代培养基上（MS+6-BA 0.4 mg·L-1）。25 ℃培养，光照时间为16 h·d-1。

1.2.2 热处理脱毒 将茎尖组培苗分成单株，接种于继代培养基上，25 ℃预培养10 d 后进行热处理，保持16 h·d-1光照。设置3 种热处理：36 ℃恒温培养30 d（R1）；起始温度32 ℃，按1 ℃·d-1升至38 ℃后培养30 d（R2）；40 ℃恒温培养4 d（R3）。每处理10 株，3 次重复；热处理后在25℃条件下继续培养。

1.2.3 草莓总RNA 提取和cDNA 合成 使用EASYspin 植物RNA 快速提取试剂盒提取草莓组织总RNA。取1.5 μL RNA，dNTP 2 μL，Oligo（dT）18 Primer 和Random Primer（9 mer）各0.5 μL，加入DEPC 水至15.5 μL。65 ℃ 5 min，冰浴5 min，加入5× M-MLV 逆转录反应缓冲液4 μL、M-MLV反转录酶和RRI 抑制剂各0.5 μL；42 ℃ 1 h，70 ℃15 min，合成cDNA，于-20 ℃保存。

1.2.4 RT-PCR检测利用RT-PCR进行病毒检测，包括SMYEV、SVBV、SMoV、SCV 和CMV，各种病毒检测相应的特异性引物见表1。以2 μL cDNA 为模板，加正、反向引物各0.5 μL，2×TaqPCR Mix 12.5 μL，加ddH2O 至25 μL。反应条件为：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，退火1 min（退火温度见表1），72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃ 10 min。PCR 产物采用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

表1 用于RT-PCR 检测的引物信息

1.2.5 SMYEV RT-qPCR 检测 检测引物为SY5289F1（5 ＇ -CGCTGCTGCCAGTAATAAGG-3＇）和SY5434R1（5＇-CGAGGGCGAGGAACCAA T-3＇），以cDNA 为模板进行PCR 扩增后，目的片段长度为145 bp（王建辉 等，2016）。采用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒回收PCR 产物，连接到pBM-23 载体上，转化感受态细胞BMMach1-T1，37 ℃过夜培养，通过以上引物进行菌落PCR 筛选，阳性菌落进行克隆测序。将测序序列正确的阳性克隆用高纯度质粒小量快速提取试剂盒提取质粒，于-20 ℃保存。

应用Nanodrop 2000 测定质粒浓度，计算质粒浓度拷贝数。

拷贝数=（质粒浓度× 10-9× 6.02 × 1023）/〔（载体长度+插入目的片段的长度）× 660〕

使用ddH2O 稀释SMYEV 质粒标准品。取稀释倍数为1 × 102～1 × 107的标准品，在QuantStudioTM6 Flex 实时荧光定量PCR 仪上进行RT-qPCR 检测，每组试验3 次技术重复，制定标准曲线。

利用实时荧光定量PCR 检测体系，对草莓叶片中的SMYEV 进行检测。以1 μL cDNA 为模板，加 入SY5289F1、SY5434R1和ROX矫正染料各0.4μL，GenFQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，加ddH2O 至20 μL。反应条件为：95 ℃ 3 min，95 ℃10 s，60 ℃ 10 s，40 个循环。

2 结果与分析

2.1 市售草莓组培苗病毒的RT-PCR 检测

2014—2022 年共检测450 份红颜组培苗样品，病毒阳性样品的总检出率为20.2%。不同年份的病毒检测结果不同，根据检测出的病毒种类不同，将检测结果进行了汇总（表2）。2014—2017 年，北京地区红颜组培苗共检测出5 种病毒，分别为SMYEV、SVBV、SMoV、SCV 和CMV。SVBV的检出率最高，为15.0%；SMoV、SCV 和CMV的检出率依次为10.2%、8.4%和3.0%；SMYEV 的检出率仅为1.8%；复合侵染率6.6%。2018—2021年仅检测到3 种病毒，分别为SMYEV、SVBV 和SMoV。其中SMYEV 的检出率为4.1%，SVBV的检出率为6.6%，SMoV 的检出率为0.8%，复合侵染率0.8%。2022 年仅检测出2 种病毒，即SMYEV 和SVBV，检出率分别为24.4%和2.4%，且复合侵染率为0。

表2 红颜组培苗病毒的RT-PCR 检测结果

可见，近9 年SMYEV 的检出率明显上升，SVBV 和SMoV 检出率逐渐下降，2018 年后未在红颜组培苗中检测出SCV 和CMV。2022 年红颜组培苗中SMYEV 的检出率高达24.4%，远超其他病毒。

2.2 草莓茎尖组织培养和病毒的RT-PCR 检测

2021 年对北京地区草莓农业园内红颜病毒病的发生情况进行调查，采集经RT-PCR 鉴定携带SMYEV 的匍匐茎16 个、携带SVBV 的匍匐茎21个。在解剖镜下切取长度为0.3 mm 的茎尖进行组织培养，茎尖萌发率为100.0%。

提取上述经茎尖组培的红颜组培苗新叶RNA，进行RT-PCR 检测。结果表明，SMYEV的脱除率为25.0%，SVBV 的脱除率为100.0%，表明茎尖组织培养无法有效脱除红颜组培苗中的SMYEV。

2.3 不同热处理对草莓茎尖组培苗生长的影响

将上述不能通过茎尖组织培养脱除SMYEV 的组培苗分成单株，接种于继代培养基上，进行不同热处理后的红颜茎尖组培苗存活率见表3。36 ℃恒温培养30 d 后，红颜茎尖组培苗下部叶片全部枯死，出现大量全株死亡现象，存活率为43.3%。32 ℃逐步升温培养7 d 时，红颜茎尖组培苗叶片稍有萎蔫；38 ℃培养30 d 后，红颜茎尖组培苗下部叶片出现枯死，有个别全株死亡现象，存活率为63.3%。40 ℃恒温培养4 d 后，红颜茎尖组培苗仅一半植株长出新芽，存活率为50.0%。

表3 不同热处理方式对红颜茎尖组培苗存活率的影响

2.4 SMYEV RT-qPCR 标准曲线的建立

SMYEV 质粒浓度为193.6 ng·μL-1，换算成拷贝数为4.49 × 1010个·μL-1。在拷贝数为4.49×103～4.49 × 108个·μL-1范围内，Ct 值与质粒标准品浓度间呈线性关系（图1）。标准曲线方程为y=-3.197 1x+35.387，决定系数R2=0.998 6，扩增效率为105%，该标准 曲线可用于SMYEV 含量的测定。

图1 实时荧光定量PCR 的标准曲线

2.5 不同热处理脱除SMYEV 的效率

待热处理的红颜茎尖组培苗长出新叶后，通过RT-PCR 和RT-qPCR 进行病毒检测，以确认SMYEV 的脱除率。结果表明（图2、表4），RTPCR 和RT-qPCR 的检测结果一致，3 种热处理方式的SMYEV 脱除率皆为100.0%。

图2 热处理前后红颜茎尖组培苗中SMYEV 的RT-PCR检测结果

表4 不同热处理方式对红颜茎尖组培苗SMYEV 脱除率的影响

3 结论与讨论

脱毒种苗的应用是草莓安全生产的基础。目前生产上的一个认识误区是将草莓茎尖组培苗视作脱毒苗，但市场上的组培苗大多没有经过病毒检测。本试验对近9 年市售红颜组培苗进行了病毒检测分析。2014—2022 年市售红颜组培苗受到5 种草莓病 毒（SMYEV、SMoV、SVBV、SCV 和CMV）的侵染，阳性样品的总检出率为20.2%。而2022年侵染红颜组培苗的病毒仅为SMYEV 和SVBV。经过多年对红颜组培苗的病毒检测，发现病毒的种类和检出率有明显变化。病毒种类减少、检出率降低与草莓茎尖组织培养技术的应用有关，故推测通过茎尖组织培养可脱除某些病毒，但无法达到完全脱毒的效果。

本试验采集携带SMYEV 和SVBV 的红颜匍匐茎进行茎尖组培，发现不能有效脱除草莓体内的SMYEV。组织培养时减小茎尖长度能提高病毒脱除率，但会大大降低茎尖萌发率，影响生产效率且不易操作（Bettoni et al.，2022）。热处理能降 解病毒，抑制病毒的复制和扩散，但处理不当会影响组培苗的存活率（Krizan et al.，2009；Xiang et al.，2020）。本试验测定了3 种热处理方式对红颜茎尖组培苗体内SMYEV 的脱除效果，发现茎尖组培苗的存活率不同，但SMYEV 的脱除率均为100.0%。

结合组培苗存活率和病毒脱除率来看，热处理脱毒应使用逐步升温法，而不是恒定的高温。采用起始温度为32 ℃，按1 ℃·d-1升至38 ℃后培养30 d，可有效脱除红颜茎尖组培苗中的SMYEV，对 于草莓脱毒种苗的生产有重要意义。

降低继代培养基中细胞分裂素6-BA 的浓度，能提高草莓组培苗的存活率；而施加水杨酸（SA）能提高病毒的脱除率（Magyar-Tábori et al.，2021）。不同品种同一病毒的脱除效果差异较大（Hu et al.，2019）。如，苹果茎沟病毒（apple stem grooving virus，ASGV）经热处理后在嘎拉和瑞雪2 个苹果品种的分生组织都能检测到，但瑞雪的脱毒效果比嘎拉好（Wang et al.，2020）。故SMYEV侵染不同草莓品种的分生组织能力也可能不同。今后应进一步提高热处理草莓组培苗的存活率和脱毒率，并对不同草莓品种的热处理脱毒方式进行探究。