抗根肿病结球甘蓝OguraCMS种间恢复材料的创制

杨 鼎 吕凤仙 李崇娟 徐学忠 胡靖锋 杨红丽 兰梅 张丽琴 董相书 和江明*

（1 云南大学，云南昆明 650504；2 云南省农业科学院园艺作物研究所，云南昆明 650205；3 国家蔬菜改良中心云南分中心，云南昆明 650205）

根肿病是一种世界性病害，主要危害十字花科作物，在我国北到黑龙江，南到广东、广西都有分布，而四川、山东、湖北、云南、重庆等地是我国根肿病发生重灾区（孙朝辉 等，2016）。结球甘蓝（BrassicaoleraceaL.var.capitataL.）简称甘蓝，为两年生十字花科芸薹属蔬菜作物，是我国重要的蔬菜作物之一，年种植面积约90 万hm2（杨丽梅等，2021）。近年来，甘蓝根肿病发生面积急剧增加，导致其品质和产量大幅度下降，甚至绝收（孙超 等，2016），急需育成抗病品种来解决困境。目前，结球甘蓝抗病品种均为国外Ogura CMS 品种，转育十分困难，不利于优异种质获得、利用。因此，创制具有Ogura CMS 恢复基因的抗根肿病甘蓝材料对于甘蓝抗病聚合育种具有重大意义。前人通过对甘蓝及其变种的抗性发掘，发现抱子甘蓝和欧洲的各种野生甘蓝抗性较强，但均存在抗性遗传不稳定、不易转育的问题（Crisp et al.，1989；陈欣 等，2015）。国外通过种间杂交等手段，将萝卜中的抗性基因转移到甘蓝中，获得了一些抗病品种，如美国的先甘809、日本龙井275 等；但是国内可以利用的甘蓝根肿病抗源材料较少，并且存在抗性单一的问题，例如CR49、CR52 等（司军 等，2008）。

自Ogura CMS不育胞质转育到芸薹属作物中，国内外育种家通过体细胞融合、远缘杂交等方法将外源Rfo、Rfk1（Rfo基因的同源基因）育性恢复基因转移到甘蓝型油菜和白菜型油菜中，使其育性得到恢复（Delourme et al.，1998；Niemelä et al.，2010）。中国农业科学院蔬菜花卉研究所甘蓝育种团队利用含有Rfo育性恢复基因的甘蓝型油菜与Ogura CMS 芥蓝远缘杂交，将甘蓝型油菜中的Rfo育性恢复基因导入到桥梁材料芥蓝中，再与芥蓝进行多代回交、标记筛选、育性和细胞学观察，获得了结实性正常、育性恢复稳定、形态与芥蓝一致，染色体数为18 条（2n=18）的芥蓝Ogura CMS 育性恢复材料（Yu et al.，2016，2017）；随后将所获得的芥蓝恢复材料与Ogura CMS 抗根肿病甘蓝材料进行杂交，获得了含有CRb抗性基因的甘蓝材料（于海龙，2018），通过该材料进行育性恢复-胞质替换两步法和多代回交、自交，最终获得了CRb基因纯合的根肿病抗性甘蓝材料（Ren et al.，2020），成功以芥蓝为桥梁获得育性恢复的抗根肿病甘蓝材料。

本试验以对根肿菌4 号生理小种有良好抗性的先甘336 作为母本，与甘蓝型油菜Ogura CMS 恢复材料N21015 进行种间杂交，通过甘蓝和甘蓝型油菜杂交复合种的获得，以期将良好的根肿病抗性基因和恢复基因转移到杂种中，获得对根肿菌4 号生理小种具有抗性且携带恢复基因的种间材料，为从源头上解决抗根肿病甘蓝育种的难题奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试甘蓝品种先甘366 对根肿菌4 号生理小种具有良好抗性，购自先正达公司；经室内苗期人工接种抗病性鉴定和分子标记鉴定确定不含根肿病抗性基因的甘蓝材料GL21028，甘蓝型油菜Ogura CMS 恢复材料N21015 和不含恢复基因的N160R均由云南省农业科学院园艺作物研究所十字花科课题组提供。

供试菌种采集于云南省昆明市嵩明县根肿病多发地区的甘蓝肿根，经Williams 鉴定系统鉴定为4号生理小种，甘蓝肿根清洗后保存于-20 ℃冰箱中。

1.2 试验方法

1.2.1 材料种植 2021 年种植在云南省农业科学院嵩明科研基地设施大棚内，先甘366、GL21028、N160R 于3 月1 日播种，N21015 于4 月20 日播种；选取颗粒饱满的种子，采用50 孔穴盘和育苗专用基质进行育苗，每份材料3 盘。

1.2.2 DNA 提取及含量测定 幼苗长出第1 片真叶时，使用北京全式金生物技术股份有限公司的DNA 试剂盒提取DNA。分别取100 mg 子叶于-20℃冷冻，采用叶片研磨机研碎后参照试剂盒流程提取DNA；然后，使用1× TE 缓冲液溶解稀释DNA至100 ng·μL-1，1%琼脂糖凝胶电泳及核酸检测仪检测DNA 的质量。置于-20 ℃冰箱中保存，备用。

1.2.3 甘蓝根肿病表型鉴定 3 月15 日，先甘366和GL21028 幼苗长出2 片真叶后，控水处理1 d，然后采用注射法分别接种根肿菌4 号生理小种菌液，接种浓度为1 × 108个·mL-1，每穴1 mL；以分别注射1 mL 蒸馏水作为空白对照，每处理1 盘。接种45 d 后，参考司军等（2009）的分级标准分别统计甘蓝植株根肿病发病情况。

1.2.4 甘蓝抗根肿病分子标记筛选 利用孙超等（2016）、何海燕（2018）、刘笑颜（2020）、甘彩霞等（2022）设计的7 对与根肿病相关抗性基因连锁的分子标记（表1），以不含根肿病抗性基因的GL21028 为对照，参照兰梅等（2021）的方法对先甘366 进行分子标记鉴定。分别以先甘366、GL21028 的DNA 作为模板，依次采用7 对引物进行PCR 扩增；然后取PCR 产物1 μL，250 V、30 min 条件下使用1.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测，在Bio-rad 凝胶成像系统上进行观察并拍照，筛选出适合本试验的抗根肿病分子标记，即在先甘366中具有条带而在GL21028 中无条带的引物。

表1 甘蓝根肿病抗性基因引物序列

1.2.5 甘蓝型油菜Ogura CMS 恢复基因分子标记筛选利用Primard-Brisset 等（2005）、Hu 等（2008）、杨其东等（2016）设计的7 对与Ogura CMS 恢复基因相关的分子标记（表2），以不含恢复基因的N160R 为对照，对N21015 进行分子标记鉴定，方法同1.2.4。筛选出适合本试验的恢复基因分子标记，即在N21015 中具有条带而在N160R中无条带的引物。

表2 甘蓝型油菜恢复基因引物序列

1.2.6 种间杂交胚挽救 4 月1 日，将6 片真叶的先甘366 幼苗转移至人工冷库，4 ℃条件下春化75 d，然后定植于单独隔离的大棚内，常规管理；N21015 同时定植。杂交前摘除父、母本开放花朵，套袋隔离，父本开花1～2 d 进行杂交，取母本3 mm 长的花蕾剥蕾授以父本花粉，配制先甘366 × N21015 杂交组合。授粉后套袋隔离，防止其他花粉污染。杂交12 d 后，取荚进行胚挽救。参照姜娇（2018）的胚挽救培养基研究结果，配制种间杂交胚挽救培养基E（MS+0.5 mg·L-16-BA +0.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT+1 mg·L-1AC +5 g·L-1CH），挑选绿色、饱满的胚珠接种到该培养基上，在（25 ± 2）℃、光照12 h·d-1、光照强度1 500 lx 的条件下进行培养；成功分化的胚珠转移到培养基D（MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT+1 g·L-1AC+3 g·L-1CH）上，继续培养；分化至具有完整植株形态后，转接到1/2 MS 培养基上继续培养。待植株生根并长出1 对真叶后，将根长3 cm 左右的幼苗定植于蛭石基质中，在（25 ± 2）℃、光照12 h·d-1、光照强度2 000 lx、相对湿度65%条件下进行炼苗；成活植株于7 d 后室外常规管理，15 d 后移栽至大棚内，常规水肥管理。

1.2.7 种间杂种人工诱导染色体加倍 8 月11 日，在移栽成活的种间杂种植株腋芽和生长点处滴0.2%秋水仙素50 μL，每天1 次，连续处理3 d。待植株抽薹开花后，于盛花期对植株花粉进行观察，对花粉正常的植株进行花粉育性检测。于晴天上午11：00—12：00 采集具有正常花粉的花朵，使用亚历山大染液进行染色观察，每朵花统计400 个花粉粒，计算花粉可育率，判断植株是否恢复育性。

1.2.8 种间杂种鉴定 ①形态学观察：成活后的杂种植株，在生长茂盛时期观察叶形、叶色、叶面特征、花器官的颜色大小等性状，并分别与两个亲本进行比较，判断杂种真实性。

② 染色体分析：以父、母本及F1杂种植株为试材，参考Yang 等（2017）的方法进行雌蕊染色体观察，统计杂种雌蕊染色体数目，对经染色体诱导加倍成功和未加倍处理的F1杂种植株进行对比分析，并与父、母本进行比较，判断杂种倍性及其真实性。

③分子标记鉴定：以F1杂种幼嫩叶片为试材，提取DNA，方法同1.2.2。利用1.2.4、1.2.5 筛选出来的引物进行PCR 扩增，使用1.8%琼脂糖凝胶电泳对PCR 产物进行检测，观察条带位置，分别与母本抗根肿病基因条带和父本恢复基因条带进行对比，判断杂种是否携带根肿病抗性基因和Ogura CMS 恢复基因。

④ 抗根肿病表型鉴定：以F1杂种植株为试材，接种根肿菌，方法同1.2.3，统计杂种植株根肿病发病情况，结合分子标记鉴定结果，判断杂种是否获得抗性遗传。

2 结果与分析

2.1 DNA 检测结果

试验结果表明，先甘366、GL21028、N21015、N160R 提取的DNA 均表现为条带清晰、整齐，无拖尾现象，说明提取的DNA 质量较好。核酸检测仪检测显示，4 份材料单株DNA 样品浓度在800～2 000 ng·μL-1之间，A260/A280在1.9～2.0之间，证明DNA 质量可以满足后续分子标记鉴定要求。

2.2 甘蓝根肿病表型鉴定结果

对先甘366 和GL21028 进行室内苗期人工接种抗病性鉴定，结果如图1 所示。不含根肿病抗性基因的GL21028 接种处理完全发病，发病级别最高达7 级；而先甘366 接种处理以及2 份材料的空白对照均未出现发病植株，说明先甘366抗根肿病。

图1 甘蓝根肿病室内苗期人工接种鉴定结果

2.3 甘蓝抗根肿病分子标记筛选结果

利用7 对已知与根肿病相关抗性基因连锁的分子标记引物对先甘366 和GL21028 进行鉴定，凝胶电泳结果如图2 所示。Crg-1 和Crg-2 在先甘366 中具有清晰条带，而在GL21028 中没有条带或条带不清；Crg-3、Crg-4、Crg-6 在先甘366 和GL21028中都没有条带；Crg-5 在GL21028 中有清晰条带，但在先甘366 中条带不清；Crg-7 在先甘366 和GL21028 中都有清晰条带。综上，Crg-1 和Crg-2 两对引物可以鉴定出先甘366 携带抗性基因，适用于本试验，可以用作后续子代的抗性遗传鉴定。

图2 甘蓝抗根肿病分子标记筛选结果

2.4 甘蓝型油菜Ogura CMS 恢复基因分子标记筛选结果

利用7 对与Ogura CMS 恢复基因相关的分子标记引物对N21015 和N160R 进行鉴定，凝胶电泳结果如图3 所示。Rfo-1、Rfo-4 和Rfo-6 在含有恢复基因的N21015 中具有清晰条带，在不含恢复基因的N160R 中没有条带；Rfo-2、Rfo-7 在N21015和N160R 中均没有清晰条带；Rfo-3、Rfo-5 在N21015 和N160R 中均出现清晰条带。综上，引物Rfo-1、Rfo-4、Rfo-6 可以鉴定出N21015 携带恢复基因，适用于本试验，可以用作后续子代的恢复基因鉴定。

图3 甘蓝型油菜Ogura CMS 恢复基因分子标记筛选结果

2.5 种间杂交胚挽救结果

先甘366 × N21015 种间杂交后，在母本植株上自然结实率为0，而杂种胚珠在培养基E 上成功萌发（图4-A），获得了种间杂种植株，证明甘蓝×甘蓝型油菜种间杂交后代不结实，需要通过人工胚挽救培养，才可以获得杂种后代。

图4 先甘366 × N21015 胚挽救过程

将增殖分化的胚珠转移到培养基D 上，愈伤组织在该培养上增殖效果较好（图4-B），表明该培养基适合用作先甘366 × N21015 杂种后代的增殖培养。将增殖后具有完整植株形态的幼苗转接到1/2 MS 培养基上能够很好地生长，并形成良好的根系（图4-C），表明1/2 MS 培养基适合杂种后代的生根培养。炼苗过程中，在（25 ± 2）℃、光照12 h·d-1、光照强度2 000 lx、相对湿度65%条件下幼苗生长良好，移栽到田间后全部成活。

2.6 种间杂种染色体诱导加倍及育性鉴定结果

使用0.2%秋水仙素对移栽成活的幼苗连续处理3 次，成功获得染色体加倍的F1杂种。由图5-A、B 可见，染色体加倍成功的杂种植株茎叶比未加倍杂种植株肥大。花粉正常的花朵花粉育性检测结果表明，杂种植株花粉可育率为78.46%（图5-C、D），育性正常，染色体诱导加倍成功，成功获得可育的异源六倍体种间杂种。

图5 种间杂交F1 染色体诱导加倍及花粉育性情况

2.7 种间杂种鉴定结果

2.7.1 形态学表现 由图6 可见，先甘366 ×N21015 种间杂种植株各性状皆介于亲本之间，叶片形状为卵圆形，叶色墨绿，有少量蜡粉，与母本更为接近；叶柄着生3 对小叶，叶片生长松散，植株形态与父本更为接近；花朵颜色为黄色，花瓣“十”字形，形状近似圆形，更接近父本，花朵大小介于父、母本之间。综上，可初步判断所得杂种植株为先甘366 × N21015 种间杂交所得真杂种。

图6 先甘366 × N21015 种间杂交植株及花器官形态

2.7.2 染色体分析 由图7 可知，未加倍的种间杂交F1雌蕊染色体数目为28 条，加倍后的F1雌蕊染色体数目为56 条，是未加倍的2 倍，且为母本先甘366（2n=18）与父本N21015（2n=38）染色体数目之和。表明，杂种植株均为真杂种，且染色体诱导加倍成功，成功获得异源六倍体种间杂种。

图7 种间杂交F1 未加倍和加倍雌蕊染色体情况

2.7.3 分子标记鉴定结果 对种间杂种进行根肿病抗性基因分子标记鉴定，结果如图8 所示。利用Crg-1 和Crg-2 两对引物进行PCR 扩增，杂种条带清晰，且均与母本先甘366 的条带位置一致，表明杂种携带母本的根肿病抗性基因。

图8 种间杂交F1 抗根肿病分子标记鉴定结果

对种间杂种进行Ogura CMS 恢复基因分子标记鉴定，结果如图9 所示。利用Rfo-1、Rfo-4、Rfo-6 等3 对引物进行PCR 扩增，杂种均有与父本N21015 位置相同的条带，表明杂种携带父本含有的Ogura CMS恢复基因。

综上所述，先甘366 × N21015 种间杂交F1同时具有母本的根肿病抗性基因和父本的Ogura CMS恢复基因，所得杂种为真杂种。

2.7.4 抗根肿病表型鉴定结果 由图10 可知，种间杂种接种处理、空白对照以及GL21028 空白对照均未出现发病植株，而GL21028 接种处理植株全部发病。参照司军等（2009）的标准，杂种对根肿病表现为免疫，表明所得到的种间杂种具有母本的根肿病抗性基因，与分子标记鉴定结果一致。

图10 种间杂交F1 根肿病发病情况

3 讨论与结论

传统抗病育种采用单一表型鉴定的方法，易受环境影响，且费时费力，而通过表型鉴定结合分子标记不但能够快速进行筛选，还能准确鉴别出所期望性状。司军等（2011）、袁天成（2014）、梁峰豪等（2019）、李倩等（2021）通过室内苗期人工接种和分子标记辅助鉴定，筛选出对根肿病具有抗性的甘蓝和甘蓝型油菜材料，并构建了相关的分级标准。本试验采用室内苗期人工接种抗病性鉴定方法，参考司军等（2009）的病害分级标准，成功对母本抗根肿病甘蓝品种先甘366 和不抗根肿病甘蓝材料GL21028 在表型上进行了区分，确定先甘366对根肿病具有抗性。同时，使用何海燕（2018）设计的甘蓝根肿病连锁SCAR 分子标记Crg-1、Crg-2，甘彩霞等（2022）设计的针对RsCr2的SSR 分子标记Crg-7，孙超等（2016）设计的针对抗根肿病同源基因CRa、Crr1a的分子标记Crg-3、Crg-4，刘笑颜（2020）设计的针对根肿病抗性基因CRd、CRb的分子标记Crg-5、Crg-6，筛选出对本试验适用的2 对引物Crg-1 和Crg-2。对先甘366 × N21015 种间杂交F1进行抗根肿病表型鉴定和分子标记鉴定，结果表明获得的种间杂种对根肿病表现为免疫，携带母本的根肿病抗性基因。

我国甘蓝抗根肿病品种很少，且适应范围很窄，因此国内对于根肿病的防治主要集中在物理和化学方法上，但防治效果均不理想，所以选育抗病品种是防治根肿病最根本的办法。沈舒（2019）、曾爱松等（2021）通过远缘杂交将白菜的根肿病抗性基因导入到甘蓝中，获得了抗根肿病的甘蓝材料，种间杂种的遗传背景与甘蓝相似度较高于海龙（2018）以Ogura CMS 芥蓝为母本，以携带恢复基因的甘蓝型油菜为父本，结合Ogura CMS 恢复基因分子标记进行背景筛选，成功将相关恢复基因导入到母本中，获得具有育性恢复的种间杂种，通过不断回交获得染色体为19 条且含有恢复基因的芥蓝材料；姜娇（2018）通过将于海龙（2018）获得的含恢复基因的芥蓝材料与抗根肿病的Ogura CMS 甘蓝进行杂交，获得了含有根肿病抗性的种间杂种材料。石汶汶（2019）以Ogura CMS 甘蓝为母本，以携带恢复基因的甘蓝型油菜为父本，通过胚挽救成功创制出甘蓝Ogura CMS BC1四倍体杂种育性恢复材料。本试验利用Primard-Brisset等（2005）、Hu 等（2008）和杨其东等（2016）设计的针对Rfo恢复基因分子标记的7 对引物，对N21015 和N160R 进行初步筛选，筛选出了对本试验适用的3 对引物Rfo-1、Rfo-4 和Rfo-6。对先甘366 × N21015 种间杂交F1进行分子标记鉴定，结果表明成功获得了含有Ogura CMS 恢复基因的种间杂种。

胚挽救可以解决远缘杂交不结实的问题，姜娇（2018）、石汶汶（2019）通过胚挽救成功获得了甘蓝和甘蓝型油菜的种间杂种。本试验亦利用胚挽救对甘蓝×甘蓝型油菜种间杂种进行培养，使用的培养基E（MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg ·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT+1 mg·L-1AC+5 g·L-1CH）能够为杂种胚珠提供很好的生长条件，获得生长良好的愈伤组织；而增殖培养基D（MS +0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT+1 g·L-1AC+3 g·L-1CH）对愈伤组织具有良好的诱导效果，能够形成多个生长点。表明增殖培养基添加水解酪蛋白（CH）和活性炭（AC）对种间杂种胚挽救增殖组织生长有利，可以成功得到种间杂种，这与姜娇（2018）的研究结果一致，但是在培养基植物激素添加的量上有所差别，可能是因为不同基因型所得到的种间杂种对不同植物激素的需求量有所不同。对增殖培养后具有植株形态的绿植体，使用1/2 MS 培养基对成苗和生根都具有良好的效果，这与吕凤仙等（2021）生根培养基需要添加植物激素有所不同，表明不同杂种生根所需条件不一样。因此，实际应用中应该考虑不同品种的植物学特性，适当选择各种植物激素的配比浓度。

本试验得到的种间杂种为异源三倍体，减数分裂染色体无法正常联会配对，从而不具有育性。人工诱导染色体加倍后植株恢复育性，花粉活力较好，植株形态偏向于甘蓝型油菜，这与于海龙（2018）的研究结果相同，可能是因为甘蓝型油菜的遗传背景在杂种中占比较大。本试验通过远缘种间杂交和胚挽救，在表型鉴定结合分子标记的基础上，快速对亲本和杂种进行背景筛选和鉴定，成功获得了同时携带根肿病抗性基因和Ogura CMS 恢复基因的甘蓝×甘蓝型油菜杂种F1，为后续甘蓝抗性育种和恢复材料的创制奠定了基础。