肿瘤源性外泌体在头颈肿瘤免疫治疗方面的研究进展

刘之畅，杨志超(综述)，王建星，单春光(审校)

(河北医科大学第二医院耳鼻喉科，河北 石家庄 050000)

头颈肿瘤是世界范围内常见的恶性肿瘤，超过90%的头颈肿瘤是鳞状细胞癌[1]。大量流行病学研究表明：烟草和酒精滥用以及人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的感染会导致头颈鳞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)的发生，但确切病因尚不清楚[2]。迄今为止，头颈肿瘤的治疗主要采用手术治疗切除原发区癌组织及淋巴结，并配合以放疗化疗及使用细胞抑制剂。头颈肿瘤早期症状不明显且易转移，患者术后1年生存率仅50%左右[3]。为了改善患者预后及术后生活质量，亟须寻找可替代的早期诊断和治疗方法。越来越多的研究表明，肿瘤源性外泌体(tumor-derived exosome,TEX)在肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)中对免疫抑制系统形成中具有重要作用。TEX上的表面配体能够诱导受体细胞中的信号级联反应，从而导致TME中细胞的功能重编程并促进免疫抑制肿瘤相关免疫系统的形成[4]。现从TEX对TME中免疫系统的改变，来探讨头颈肿瘤的免疫治疗。

1 外泌体的生物起源及作用

外泌体的研究可追溯到1946年由Chargaff和West提出的超微米胞外囊泡。随着技术不断创新，人们普遍认为超微米胞外囊泡可参与各种生理活动及细胞信号转导，直到1980年，科学家在大鼠网织红细胞中开始报道了胞外囊泡的生物合成过程。1987年，Johnstone命名胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)为外泌体，并且直到90年代后期，外泌体的生物起源及结构特征才被人们发现。

外泌体的定义基于囊泡大小及产生机制,目前分为三类：囊泡直径<100 nm的称之为外泌体；直径为100～1 000 nm的囊泡称为多囊泡(microvesicles，MVs)或脱落颗粒；>1 000 nm的囊泡称为凋亡小体。现代人们大多接受的定义是由晚期核内体向多泡体分化并随后从细胞中释放而产生的直径<150 nm的小泡称为“外泌体”。外泌体的生物起源是一个严格调控的过程:它始于早期核内体向内再生形成管腔内囊泡(intra-luminal vesicles，ILVs)，进而成熟成为多囊泡体(multivesicular bodies,MVBs)；然后MVBs与各种细胞类型的细胞膜融合，在细胞外释放ILVs作为外泌体，亦或被溶酶体或自噬体吞噬降解[5](图1)。

图1 外泌体的生物起源示意图

外泌体主要由蛋白质、核酸和脂质构成。不同细胞来源的外泌体拥有一些相同的蛋白质如CD9、CD82、hsp70、hsp90等，这些可作为外泌体的生物标记物。不同细胞来源的外泌体带有亲族细胞的特性[6]，并充当肿瘤和免疫细胞的在肿瘤微环境内和远处穿梭的各种分子和因子的转运系统[4]，在细胞间通讯中发挥重要作用[7]。TEX内核酸与靶细胞融合作用于受体细胞，可调节受体细胞的蛋白表达和信号通路[8]。TEX携带货物的组成很复杂，除了含有亲缘肿瘤细胞的细胞膜和胞质成分，还包括多种蛋白质，脂质和核酸等。研究认为，TEX在受体细胞中递送和处理内容物的机制可能是通过TEX以细胞表面的配体-受体结合的方式或受体细胞吞噬TEX的方式进行的[4]。TEX膜表面富含共刺激分子和磷脂酰丝氨酸，它们不仅可以作为外泌体共同的分子标志物，还参与受体细胞对外泌体的有效摄取和细胞间的信号转导。

2 TEX介导免疫抑制

TME主要是由肿瘤细胞、内皮细胞、免疫细胞和细胞外基质共同构成的，是肿瘤细胞赖以生存的复杂环境，肿瘤细胞通过打造适合其生长的微环境，促进肿瘤的发生、发展和转移。不同细胞来源的外泌体可通过改变微环境影响受体细胞，进而影响机体的生物学功能。在头颈肿瘤的发生发展中，免疫抑制对肿瘤细胞的生存具有重要意义，也是临床诊疗的难点。多项研究表明，TEX携带免疫抑制蛋白，改变受体免疫细胞的功能，导致免疫功能障碍。本节通过TEX对头颈肿瘤微环境中免疫系统的影响来探讨头颈肿瘤发展、侵袭的机制。

多项研究表明：在TME中，TEX与免疫抑制的发生密切相关。Ghalamfarsa等[9]研究发现，促进肿瘤逃脱免疫监视的一个重要机制是通过嘌呤核苷酸和核苷等发出信号，这些信号在生理和病理条件下调节免疫反应中起关键作用。生理上，腺苷平衡促炎ATP，产生抗炎作用，保护组织免受活化免疫细胞造成的损伤[10]；病理上，肿瘤中腺苷单磷酸酶(adenosine monophosphatase,AMPase)活性的增加导致腺苷的产生增加，使得TME发生深度免疫抑制，促进癌症发生发展。此外，TEX能通过嘌呤能信号途径与受体细胞相互作用，HNSCC产生的外泌体带有嘌呤能信号途径的成分，像外切核苷酸酶CD39和CD73[9]。这些具有功能活性的酶存在于正常人和头颈肿瘤患者的血浆外泌体中，其含量在HNSCC患者的血浆中更高。CD39是一种细胞表面酶，其在肿瘤细胞、衰竭型T细胞和多抑制性细胞中高表达，是ATP水解和腺苷生成过程中的关键酶。免疫刺激分子ATP在CD39作用下转化为单磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)，AMP在CD73作用下转化为免疫抑制性腺苷，促进肿瘤免疫逃逸。此外，ludwig利用质谱法分析了HNSCC患者和正常人血浆外泌体中嘌呤代谢物的含量，研究发现早期HNSCC患者嘌呤代谢物含量升高[11]，而晚期HNSCC和淋巴结受累患者的外泌体中嘌呤代谢产物水平降低。循环外泌体中嘌呤代谢物含量和水平的变化与疾病进展相关，其中最重要的免疫抑制嘌呤代谢物是腺苷。CD45仅在有核细胞中表达，而在鳞状细胞癌中不表达，Beccard等[12]检测了TME中CD45(+)细胞和CD45(-)细胞产生外泌体和腺苷的含量，结果显示：CD45(-)细胞产生的外泌体含量远高于CD45(+)细胞，且CD45(-)外泌体产生的腺苷浓度高于CD45(+)外泌体，外泌体中的腺苷主要生成自TEX。这些证据都指明TEX携带可以促进具有免疫抑制的腺苷的生成，TEX与头颈肿瘤的免疫抑制密切相关。此外，富含腺苷的外泌体可促进腺苷A2BR介导的血管生成，进而促进头颈肿瘤的侵袭、发展[13]。

TEX除了通过腺苷影响头颈肿瘤的免疫抑制外，还作用于免疫T细胞介导免疫抑制。Beccard等[12]将活化的CD8+T细胞分别与HNSCC患者血浆外泌体和无外泌体对照组共同孵育，发现TEX中的CD8+T细胞凋亡数量显著增加。而且晚期TEX孵育环境中，CD8+T细胞凋亡数量远高于早期TEX孵育。CD69作为CD8+T细胞活化的标志，与CD45(+)外泌体相比，CD45(-)外泌体在CD8+T细胞中诱导了更强的CD69表达抑制，而CD45(+)外泌体对CD8+T细胞活性没有明显的抑制作用。值得注意的是，低分期和高分期患者的CD45(-)外泌体诱导了相似水平的CD69抑制。TEX除了通过减少CD8+T细胞的增殖并诱导其凋亡来介导免疫抑制，还促进调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)的扩张、抑制活性和抵抗凋亡。CD39是调节性T细胞分化的标志，研究表明晚期患者TEX诱导的CD39明显少于早期患者。TEX孵育后，T细胞中各种免疫应答相关基因的mRNA表达发生显著变化，表现为活化T细胞上CD69表达的减少和Tregs产生的免疫抑制腺苷的增加。此外，TEX还可以抑制CD4+T细胞的增殖。在HNSCC中,自然杀伤细胞(natural killer cell,NK cell)促进免疫抑制，NK细胞表达Fc受体CD16，因此能够参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用[14]。CD16(+)外泌体可以模拟NK细胞与抗体包覆的恶性细胞交联的功能，而不执行其细胞毒性功能,故可作为免疫抑制的介质出现。另外，与肿瘤分期低的患者相比，肿瘤分期高和晚期的患者外泌体中CD16水平明显更高。

T细胞在TME中免疫抑制的作用，已经有很多研究证据证实。然而，B细胞在抗肿瘤免疫中的作用是有争议的，有研究表明调节性B细胞(regulatory B cells,Bregs)与肿瘤进展相关，并抑制抗肿瘤免疫反应[15]。然而迄今为止，尚无证据表明源自HNSCC的TEX对B细胞的作用。有研究[16]为了验证TEX对TME中B细胞免疫抑制的影响，从健康个体中分离B细胞，并与从正常个体和HNSCC患者获得的血浆外泌体共培养4 d。之后分离B细胞并通过流式细胞术进行分析，结果表明从HNSCC组分离出的B细胞中程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1，PD-1)和淋巴细胞激活基因3(lymphocyte activation gene 3，LAG3)的表达显着增加，但是二者均可导致B细胞功能抑制，并无显著性差异。此外，研究表明，来自健康个体的外泌体和来自HNSCC患者的外泌体均携带免疫抑制货物，例如PD-L1，凋亡相关因子配体(factor related apoptosis ligand，FasL)和细胞毒性T淋巴细胞抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4)[17]等。TEX还可以通过这些免疫抑制蛋白介导免疫抑制。

PD-1/PD-L1通路是一种在TME中起作用的重要免疫抑制机制，为HNSCC基于抗体的免疫治疗提供了一个有前景的药物靶点[18]。从HNSCC患者血浆中提取的外泌体携带具有生物活性的PD-L1，抑制活化的T细胞[19]的功能。Theodoraki等[19]研究表明：外泌体上PD-L1的相对水平与疾病活性、临床分期和淋巴结转移的存在有关；外泌体PD-L1水平高的患者为活动性或晚期疾病，PD-L1水平高的外泌体强烈抑制T细胞活性，而低PD-L1水平的外泌体则没有。Theodoraki等[19]在与外泌体孵育前，在T细胞培养基中加入抗PD-1抗体，几乎完全逆转了这种免疫抑制效应。与外泌体包裹的PD-L1相比，可溶性PD-L1水平对临床结果并无影响。与整合在外泌体膜中的稳定PD-L1相比，未受保护的可溶性PD-L1的蛋白质降解增加。因此，外泌体内的PD-L1成为一种很有前途的HNSCC疾病进展的生物标志物。总的来说，在HNSCC的肿瘤微环境中，TEX对免疫功能的影响非常大。

3 免疫治疗

TEX通过各种途径促进免疫抑制，并通过各种耐药机制逃避免疫反应，导致头颈肿瘤患者预后不佳。国际上，局部晚期HNSCC的常规治疗方法是手术治疗，然后进行风险适应性辅助放化疗或者定性放化疗。近年来，临床关于肿瘤免疫治疗的研究十分火热，部分免疫治疗药物也获批成为一线治疗药物(nivolumab和pembrolizumab)。肿瘤免疫治疗主要通过增强或激活淋巴细胞杀伤肿瘤细胞从而达到抑制或消除肿瘤细胞的目的。头颈肿瘤是免疫浸润最为严重的疾病之一，免疫疗法也成为HNSCC的新方向。FDA目前批准的免疫疗法主要包括肿瘤疫苗、细胞因子、CAR-T疗法、及免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors，ICI)。免疫检查点是复杂的信号传导途径的稳态系统，介导免疫系统对靶细胞的激活或选择性耐受。HNSCC的免疫疗法主要针对T细胞抑制受体，这些受体作为免疫检查点，负责维持激活和抑制免疫反应之间的平衡。目前HNSCC的主要免疫检查点有PD-1、CTLA-4、LAG-3等。

3.1抗PD-1/PD-L1单抗治疗 基于细胞毒性T细胞ICI的免疫疗法已被证明在HNSCC中是有效的。目前，关于HNSCC的免疫检查点主要为PD-1/PD-L1，在3期临床试验中也已经验证了抗PD-1药物nivolumab和pembrolizumab的疗效，并被批准用于复发/转移HNSCC的一线治疗。KEYNOTE-048[20]研究表明：在复发/转移的晚期头颈癌中，pembrolizumab单药或联合化疗使用的效果优于EXTREME(西妥昔单抗联合化疗)方案。Pembrolizumab单药治疗改善了PD-L1综合阳性评分(combined positive score，CPS)≥1的HNSCC患者的总生存率，被FDA批准用于PD-L1CPS≥1的复发或转移性HNSCC的一线治疗药物。抗PD-1药物使用的生物标志物主要是PD-L1表达，此外，肿瘤突变负荷(tumor mutation burden，TMB)、HPV感染状态可能也存在一定相关性。在一项包含40例头颈鳞癌[19]患者的临床研究中发现患者循环外泌体PD-L1水平与肿瘤分期及淋巴结转移状态高度相关(P<0.001，0.013)，循环外泌体PD-L1水平可间接反映患者疾病进展及免疫功能，可作为头颈鳞癌病情的监测指标。

TMB一般指特定基因组区域内每兆碱基对体细胞非同义突变的个数[21]，可以间接反映肿瘤产生新抗原的能力和程度，已被证实可预测多种肿瘤的免疫治疗疗效。肿瘤特异性突变基因可产生新的蛋白，这些蛋白或其降解产物被主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)递呈至肿瘤细胞表面形成肿瘤新抗原，然后被活化的CD8+T细胞识别，从而触发靶向肿瘤的免疫反应，因此肿瘤基因突变被认为是抗肿瘤免疫治疗的前提。在对126例接受PD-1/PD-L1治疗的HNSCC患者的回顾性分析[22]中，应答性患者的TMB较高(21.3：8.2 mut/MB；P<0.01)并且与HPV(-)肿瘤的中位总生存率增加相关(TMB>10 mut/MB,总生存率为10个月；TMB<5 mut/MB,总生存率为6个月；P=0.01)。越来越多的数据证实TMB越高的肿瘤新抗原负荷越高，更有可能从ICIs治疗中获益。2020年6月16日，FDA基于Ⅱ期KEYNOTE-158试验结果正式批准TMB作为免疫治疗的生物标志物。

此外，Oliva等[23]研究表明：HPV(+)HNSCC患者相较HPV(-)HNSCC患者免疫抑制微环境更弱、淋巴细胞浸润(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)比例更高、CD8+T细胞比例更高、Treg更少。在pembrolizumab的Ⅰ期和Ⅱ期临床试验中，HPV(+)患者缓解率为22%，而HPV(-)缓解率为16%。KEYNOTE-055[24]试验中，缓解率分别为32%和14%。然而，checkmate-141临床试验中，研究数据表明HPV感染与头颈肿瘤患者总生存率无统计学差异。

3.2抗CTLA-4单抗治疗 抗PD-1治疗补充了HNSCC传统治疗，提高了患者中位总生存率和ORR。抗PD-1治疗最大缺点是不良反应率达10%～30%[25]，关于抗PD-1药的联合疗法正在积极研究。在HNSCC中，与抗PD1/PD-L1治疗相结合的最令人期待的药物之一是抗CTLA-4治疗。CTLA-4是T细胞跨膜受体，可与B7分子配体结合诱导细胞毒性T淋巴细胞抑制，负向调控免疫反应[26]。肿瘤细胞产生的免疫抑制分子转化生长因子(transforming growth factor beta，TGF-β)也可上调CTLA-4的表达。CTLA-4单抗可阻断其与B7的结合，提高HNSCC的抗肿瘤效应。尽管在HNSCC中单药具有抗CTLA4活性的证据有限，但在HNSCC的抗PD1/PD-L1治疗中添加抗CTLA4药物的联合研究进展迅速。在Ⅱ期CONDOR[27]和Ⅲ期EAGLE[25]试验中，都将抗CTLA-4抗体durvalumab单独或与tremelimumab联合使用。比较遗憾的是：在Ⅲ期EAGLE试验中，与化疗药物(西妥昔单抗、紫杉醇、甲氨蝶呤)相比，durvalumab联合tremelimumab治疗并不能改善总生存率(HR 1.04，95%CI：0.85～1.26)。但是，Durvalumab单药治疗组的反应持续时间和2年生存期得到改善，表明该药物在HNSCC治疗中具有活性。目前，PD-1与CTLA-4联合治疗的2/3期临床试验，还没有产生令人满意的结果。

Theodoraki等[28]纳入18例HNSCC患者，进行Ⅰ期临床试验接受西妥昔单抗，伊匹单抗和放疗联合治疗。对TEX和T细胞来源的外泌体进行了连续监测，将从血浆中分离出的外泌体通过免疫捕获分离为TEX和CD3+T细胞来源的外泌体。比较肿瘤在2年内复发(n=5)的患者的外泌体分子货物与在治疗后2年仍无疾病的患者(n=13)的货物，结果表明治疗后外泌体内CTLA-4含量下降。这些数据表明TEX和T细胞衍生的循环外泌体可以代替免疫细胞来监测患者对肿瘤治疗的反应。外泌体有可能作为癌症的非侵入性肿瘤和免疫细胞生物标记物。

4 结论与展望

外泌体携带的分子货物具有亲缘细胞属性，HNSCC中TEX根据肿瘤侵袭、转移需要形成TME。TEX主要通过损伤免疫细胞浸润、招募调节性T细胞、产生腺苷等途径介导免疫抑制。此外，循环外泌体不仅在免疫抑制中发挥重要作用，而且可以用作HNSCC早期诊断指标，并可作为免疫治疗的预测指标。

与已建立的治疗方法相比，免疫疗法正在迅速改变HNSCC的治疗前景，提高了生存率并降低了毒性。目前，主要的免疫治疗仍然是免疫检查点抑制剂,ICI已从R/M HNSCC的二线治疗发展为一线治疗。抗PD-1药nivolumab和pembrolizumab可以显著延长生存期，但是耐药性和不良反应仍然是临床应用的一大难点。学者们正在研究ICI的联合应用，以确定是否有更多患者可以从中受益。关于ICI在局部晚期肿瘤中使用的试验，如针对TIM-3、LAG-3、CTLA-4等抑制性免疫检查点的药物单药治疗或联合应用，并且可能带来突破性变化的Ⅲ期临床试验正在积极进行中。