高效液相色谱法测定鹿胎丹参白芍颗粒中葛根素、芍药苷及丹酚酸B含量

朱映黎 刘 磊 张建军 吕美豫 张文雅 侯新娟 王卫茜 王金凤 谷洪顺 王林元

(1 北京中医药大学，北京，100029； 2 神威药业集团有限公司，石家庄，051430； 3 北京采瑞医药科技研究院，北京，100094)

鹿胎丹参白芍颗粒由马鹿胎冻干粉、丹参、白芍、葛根、大豆异黄酮5种成分组成，具有滋补肾精、活血化瘀、祛黄褐斑的功效。方中马鹿胎补益精血，温助阳[1]；白芍补益营血，二者同用能够增强补益精血，润肤养颜之功；丹参既能活血调经，又能化瘀消斑；葛根升发清阳，输布精血，又能通经活络祛瘀[2]；大豆异黄酮调节内分泌，抗氧化，消斑养颜[3]。诸品合用，可达补肾益精，活血通经，化瘀消斑，养颜美容之效。动物及人体研究表明祛黄褐斑作用明确，已上市应用10余年(国食健注G20100485)。但目前对于鹿胎丹参白芍颗粒的质量标准仅停留在大豆异黄酮含量和马鹿胎冻干粉的氮含量的控制上，不能全面反映其发挥全部功效的内在物质质量。因此，非常有必要进一步提高和完善已上市产品鹿胎丹参白芍颗粒的质量标准，为更好地控制鹿胎丹参白芍颗粒质量、深入研究其祛黄褐斑功能机制内涵提供物质依据。

本研究拟在现行质量标准的基础上，增加葛根素、芍药苷及丹酚酸B作为质量控制成分，运用高效液相色谱法同时测定其含量并进行方法学考察，以提高该产品的可控性，完善其检验标准，为鹿胎丹参白芍颗粒的综合评价提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪(沃特世，美国，型号：Waterse2695)；超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司，型号：KQ5200E)；电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，型号：SQP]。

1.2 试剂 乙腈(上海星可高纯溶剂有限公司，批号：0114220309)；甲醇(上海星可高纯溶剂有限公司，批号：0212220401)；磷酸(上海星可高纯溶剂有限公司，批号：RH297703)。

1.3 分析样品 葛根素对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：S02M9B54875，纯度≥98%)，芍药苷对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：M28GB143089，纯度≥98%)，丹酚酸B对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：P20J10F93457，纯度≥98%)；鹿胎丹参白芍颗粒(批号：20211201，20211202，20201203)；阴性样品(不含葛根、白芍和丹参，实验室按处方自制)；中药材(亳州市京皖中药饮片厂)，本实验所用葛根、白芍、丹参均来源于实验3批中试产品的生产原料，经北京中医药大学中医学院李伟高级实验师确定3种药材分别来源于豆科植物野葛[Puerarialobata(Willd.)Ohwi]的干燥根，毛茛科植物芍药(PaeonialactifloraPall.)的干燥根，唇形科植物丹参(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根和根茎[2-4]；马鹿胎冻干粉(长春市慧源鹿业有限公司，批号：20210910T06)；大豆异黄酮(西安天一生物技术有限公司，批号：210802)；糊精(嘉康源有限公司，批号：211010)；羧甲基纤维素钠(嘉康源有限公司，批号：21040659)；D-甘露糖醇(嘉康源有限公司，批号：112104015)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Waters XBridge C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相A：乙腈(CH3CN)；流动相B：甲醇(CH3OH)；流动相C：0.05%磷酸(H3PO4)水溶液；采用梯度洗脱；流速1.0 mL/min，检测波长230 nm，柱温25 ℃，进样量：10 μL。三元梯度洗脱程序：A相：0～18 min，1%～8%；18～30 min，8%～23%；30～45 min，23%；B相：0～45 min，15%；C相：0～18 min，84%～77%；18～30 min，77%～62%；30～45 min，62%。见表1。

表1 梯度洗脱程序(%)

2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取葛根素、丹酚酸B、芍药苷对照品适量，加50%甲醇制成每1 mL含葛根素0.250 mg、芍药苷0.130 mg、丹酚酸B 0.200 mg的混合对照品溶液，摇匀，得混合对照品母液。精密量取10 mL，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取约1.000 g产品，精密称定，置25 mL容量瓶中，加入50%甲醇适量，超声处理30 min，放冷，加50%甲醇定容，精密量取上清液3 mL置10 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，即得。按照原样品配方比例及工艺，分别不含丹参、白芍、葛根制备3种阴性对照品。按照2.2.2项下的方法制备阴性对照品溶液。

2.4 专属性实验 取混合对照品、供试品及阴性样品溶液各10 μL，按“2.1”设定色谱条件进样测定。供试品中葛根素出峰时间为20.909 min，芍药苷出峰时间为25.224 min，丹酚酸B的出峰时间为37.616 min，结果阴性样品在与供试品中葛根素、芍药苷和丹酚酸B相同的保留时间处无干扰峰。见图1。

图1 专属性高效液相色谱图

2.5 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液0.5、2、4、8、16、30 μL分别注入高效液相色谱仪中，按照上述“2.1”项下色谱条件进样分析，测定峰面积。结果以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程和线性范围。见表2。

表2 直线回归方程结果

2.6 精密度实验 分别精密吸取混合对照品溶液10 μL，在上述“2.1”项色谱条件下重复进样6次，计算丹酚酸B、葛根素和芍药苷的峰面积，RSD值分别为：0.12%、0.53%和0.56%。

2.7 供试品溶液稳定性实验 精密吸取同一鹿胎丹参白芍颗粒供试品溶液，分别于0、2、6、12、18、24 h进样，计算丹酚酸B、葛根素和芍药苷的峰面积RSD值分别为：2.34%，0.57%和0.96%。

2.8 重复性实验 取同一批鹿胎丹参白芍颗粒约1.000 g，平行6份，精密称定，按上述“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样测定并计算相对标准偏差(Relative Standard Deviation，RSD)值。见表3。

表3 重复性实验结果

2.9 回收率实验 取同一批鹿胎丹参白芍颗粒约0.600 g，精密称定，分别按照0.8∶1、1∶1和1∶1.2的比例加入对照品适量，每个比例平行3份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，计算葛根素、芍药苷、丹酚酸B的平均加样回收率。见表4～6。

表4 葛根素加样回收率实验结果

2.10 样品测定结果 按照“2.2.2”项下方法制备鹿胎丹参白芍颗粒溶液，按“2.1”项下色谱条件分别测定3批样品中丹酚酸B、葛根素、芍药苷的含量，每批样品平行测定3次，并计算RSD值。见表7。

表5 芍药苷加样回收率实验结果

表6 丹酚酸B加样回收率实验结果

表7 鹿胎丹参白芍颗粒中丹酚酸B、葛根素、芍药苷含量测定结果(mg/g)

3 讨论

鹿胎丹参白芍颗粒方中各类成分相互协调、相互促进从而达到祛黄褐斑的效果。结合中药有效性-物质基础-质量控制标志性成分评价体系，采用多指标成分质量控制模式，完善鹿胎丹参白芍颗粒的质量控制，既有助于生产企业和食品药品监管部门不断提高该产品的质量控制标准，也可逐步完善鹿胎丹参白芍颗粒原药材的质量控制标准，从源头上确保鹿胎丹参白芍颗粒产品质量和临床疗效的稳定性。但目前对于鹿胎丹参白芍颗粒的质量标准仅停留在大豆异黄酮中各成分的含量测定以及马鹿胎冻干粉中氮含量的测定，不能全面反映其发挥全部功效的内在物质质量。

丹酚酸B、芍药苷和葛根素分别作为丹参、白芍和葛根中的标志性成分。其中丹酚酸B具有很强的抗氧化性，它既可通过抗氧化机制抑制黑色素的生成，也可通过改善微循环加快黑色素的清除[4-5]。芍药苷可以通过抑制氧化亢进、改善线粒体功能障碍、抑制或活化抗氧化酶相关通路、增强抗氧化能力、调节Keap1/Nrf2信号通路等多通路多靶点的方式改善氧化应激以及缓解黑色素形成[6-8]。葛根素是葛根异黄酮中的一种，能够清除氧自由基及抗脂质过氧化，通过降低酪氨酸酶的活性抑制黑色素的形成[9-10]。因此，本研究拟在现行质量标准的基础上，增加葛根素、芍药苷及丹酚酸B作为质量标准成分，运用HPLC法测定其含量并进行方法学考察。

在2020版《中华人民共和国药典》中，葛根素的测定流动相为甲醇：水，芍药苷的测定流动相为乙腈：0.1%磷酸溶液，丹酚酸B的测定流动相为乙腈：0.1%磷酸溶液。陈丽艳[11]采用HPLC同时测定葛根素、芍药苷和丹酚酸B 3种成分选用流动相为乙腈、甲醇和0.05%磷酸溶液。本实验结合鹿胎丹参白芍颗粒的配方特点，在此基础上，参照色谱峰性能、分离效果、保留时间等指标，重新调整甲醇比例为15%，使色谱分离达到最佳效果。在制备供试品溶液时，由于丹酚酸B具有热不稳定性，因此采用50%甲醇溶液超声提取进行制备，提取效果最佳[12]。并且，通过对这3种成分分别进行检测，最终确定测定波长为230 nm处各成分有较大吸收，且最晚出峰时间为35 min，因此设定检测时间为45 min。鹿胎丹参白芍颗粒中葛根素、芍药苷及丹酚酸B的相对含量为18.94、10.15、9.25 mg/g；加样回收率的RSD值分别为1.63、1.01、1.38%(RSD%<2)。表明本研究所建立的同时测定鹿胎丹参白芍颗粒中葛根素、芍药苷及丹酚酸B含量的新方法准确度高、重复性好、稳定性优，线性结果符合要求，能有效地控制鹿胎丹参白芍颗粒的质量。

目前鹿胎丹参白芍颗粒的产品规格为5 g/袋，服用方法为1袋/次，2次/d，冲饮。根据本研究建立的方法测定含量，每10 g鹿胎丹参白芍颗含有葛根素189.4 mg、芍药苷101.5 mg、丹酚酸B92.5 mg，提示其活性成分含量高，为后续探讨有效成分作用靶点，深入阐释产品作用机制，进一步开展人体小样本、大样本实验奠定物质基础。

综上所述，本研究在鹿胎丹参白芍颗粒现行质量标准的基础上，增加了葛根素、芍药苷及丹酚酸B作为含量测定项的指标性成分，建立了可同时测定鹿胎丹参白芍颗粒中葛根素、芍药苷及丹酚酸B含量的新方法，可为鹿胎丹参白芍颗粒的质量标准提升提供实验依据。