艾烟和香烟对APP/PS1双转基因小鼠海马β-淀粉样蛋白及血清炎症介质的影响

何梦如 王 昊 刘雅洁 黄跃平 吴嘉威 赵百孝

(1 北京中医药大学针灸推拿学院，北京，102488； 2 解放军总医院第六医学中心针灸科，北京，100048； 3 北京中医药大学东直门医院，北京，100007)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s Disease，AD)是一种神经系统退行性疾病，以记忆障碍、认知功能障碍以及其他神经精神症状和行为障碍为主要临床表现[1]。AD具有发病率高、危害性大的特点，是全球第7大死亡原因，也是社会经济成本最高的疾病之一[2-3]。AD的2个核心病理特征是脑内β-淀粉样蛋白异常沉积形成的老年斑和tau蛋白过度磷酸化引发的神经纤维缠结(Neurofibrillary Tangle，NFT)[4]。有研究认为大脑中持续免疫反应的存在已经成为AD的第3个核心病理特征，除了β-淀粉样蛋白异常沉积形成的老年斑和NFT外，AD患者的大脑还表现出持续的炎症反应[5]。神经炎症与β-淀粉样蛋白、NFT相互作用，共同参与AD的发病机制，加速AD病变发展[6-7]。

研究表明，空气颗粒物污染与AD发病正相关[8]。香烟烟雾作为一种常见的空气污染物，其与AD的关系一直备受争议[9-12]。而艾烟作为艾灸疗法起效过程中的关键因素之一，具有抗衰老、抗炎、抗氧化等作用及多种生物活性[13-14]。本课题组前期研究发现一定浓度(5～15 mg/m3)的艾烟可以提高AD模型动物的学习记忆功能，减少β-淀粉样蛋白沉积，改善脑内氧化应激状态，从而延缓AD病理进程[15-17]。本实验通过对比观察艾烟和香烟2种不同的烟雾干预方式对APP(β-淀粉样前体蛋白)/PS1(衰老蛋白1)模型小鼠海马β-淀粉样蛋白沉积及血清炎症介质的影响，以期探索艾烟对AD神经炎症的作用机制，并验证香烟对AD的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 本实验选用无特定病原体(Specific Pathogen Free，SPF)级24周龄雄性APP/PS1双转基因小鼠作为AD动物模型，采用同龄相同遗传背景的雄性C57BL/6小鼠作为空白对照，体质量28～32 g。小鼠均购于北京唯尚立拓生物科技有限公司[许可证号：SCXK(京)2016-0009]，所有小鼠均饲养于青岛大学医学部动物实验中心，均自由进食饮水，并采用常规小鼠饲料喂养。饲养环境温度为(22±2)℃，环境湿度为(50±5)%，采用半自动电路控制饲养室内照明，保持12 h光照(8:00～20:00)和黑暗(20:00～次日8:00)交替循环。实验过程均遵循2006年国家科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。本研究经北京中医药大学实验动物伦理委员会批准(伦理审批号：BUCM-4-2020011401-1010)。

1.1.2 试剂与仪器 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-8(IL-8)、血清淀粉样蛋白A(SAA)、C反应蛋白(CRP)酶联免疫吸附测定试剂盒(北京瑞格博科技发展有限公司，批号：20210909.60080M;60024M;60199M;60197M)，无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司，批号：10009257)，二甲苯(国药集团化学试剂有限公司，批号：10023418)。酶标仪(Thermo Fisher Scientific，美国，型号：Multiskan MK3)，石蜡切片机(LEICA，德国，型号：RM2235)，高速冷冻离心机(Thermo Fisher Scientific，美国，型号：ST16)，光学显微镜(Nikon，日本，型号：Eclipse E200)，超低温冰箱(Thermo Fisher Scientific，美国，型号：Forma902GP-ULTS)，订制小鼠灸用细艾条(湖北蕲春李时珍医药集团，规格φ8 mm×150 mm)，香烟(上海烟草集团北京卷烟厂有限公司，混合型，焦油含量11 mg，尼古丁含量1.1 mg，CO含量12 mg)，玻璃缸(自制，规格80 cm×80 cm×60 cm)，光散射式数字微电脑粉尘仪(北京宾达绿创科技有限公司，型号：P-5L2C)，小鼠固定器(北京健力园有限公司，规格150 mm×65 mm×50 mm)。

1.2 方法

1.2.1 分组 将36只24周龄雄性APP/PS1小鼠按随机数字表法分为模型组、艾烟组和香烟组，每组12只，12只具有相同遗传背景的C57BL/6小鼠作为空白组。

1.2.2 干预方法 所有小鼠适应性喂养1周后开始进行干预。将艾烟组小鼠置于小鼠固定器内，然后将固定器放入自制玻璃缸中，玻璃缸内放置已调试好的激光粉尘测试仪。点燃艾条后将艾条放置在玻璃缸角落处，使用USB(通用串行总线)电源驱动小型风扇令艾烟均匀地充满整个玻璃缸。每隔3 min用粉尘测试仪测试其烟雾浓度，使玻璃缸中的艾烟浓度控制在5～15 mg/m3之间。香烟组使用香烟烟雾进行干预，操作同艾烟组。模型组和空白组每天行抓取固定，不做其他干预。干预20 min/d，6次/周，共计8周。

1.2.3 检测指标与方法 各组干预结束后1 d，腹腔注射1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)溶液麻醉小鼠，眼球摘除法取血，经心脏灌注后取出脑组织，待切片观察。严格按照说明书标准程序操作，使用刚果红染色法比较不同组小鼠海马的β-淀粉样蛋白沉积变化，采用酶联免疫吸附试验法测定血清中TNF-α、IL-8、SAA、CRP含量。刚果红染色：小鼠海马组织切片后贴在载玻片上，然后依次放置于乙醇氯化钠溶液中5 min和刚果红乙醇氯化钠溶液中30 min，自来水冲洗。随即进行乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂胶封固。使用光学显微镜进行观察、拍照，刚果红染色阳性表现为橘红色颗粒。酶联免疫吸附试验法：使用眼球摘除法取血1.0～2.0 mL，置于离心管中静置1 h左右，离心15 min(4 ℃，2 500 r/min，离心半径10 cm)。离心后取上层血清放入冻存管中，-80 ℃冰箱中保存待检测。按照酶联免疫吸附试验试剂盒说明书进行操作，使用酶标仪在450 nm波长下测量各孔的吸光度值(A值)。根据标准品的浓度及对应的A值，以A值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的A值在回归方程上分别计算出血清TNF-α、IL-8、SAA、CRP的含量。

2 结果

2.1 各组小鼠海马β-淀粉样蛋白沉积情况 空白组小鼠海马未见明显橘红色物质沉积，细胞排列整齐；模型组小鼠海马可见明显橘红色β-淀粉样蛋白沉积(箭头所指)，呈点斑片状，大小不一，细胞排列散乱、稀疏；香烟组小鼠见大量橘红色β-淀粉样蛋白沉积，细胞排列不整，见较多空隙，细胞凋亡坏死较严重；艾烟组小鼠海马见散在橘红色β-淀粉样蛋白沉积，细胞排列整齐，偶见神经元缺失造成的空隙。见图1。

图1 各组小鼠海马β-淀粉样蛋白沉积情况(刚果红染色)

2.2 各组小鼠血清TNF-α、IL-8、SAA、CRP表达情况

2.2.1 各组小鼠血清TNF-α含量比较 各组小鼠血清中TNF-α的含量由高到低依次是香烟组>模型组>艾烟组>空白组。与空白组比较，模型组、香烟组小鼠血清TNF-α明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，艾烟组差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，香烟组小鼠血清TNF-α含量有升高趋势但差异无统计学意义(P>0.05)，艾烟组小鼠血清TNF-α含量有下降趋势但差异无统计学意义(P>0.05)；与香烟组比较，艾烟组小鼠血清TNF-α含量显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2.2 各组小鼠血清IL-8含量比较 各组小鼠血清中IL-8的含量由高到低依次是香烟组>模型组>艾烟组>空白组。与空白组比较，模型组、香烟组和艾烟组小鼠血清IL-8均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，香烟组小鼠血清IL-8含量有升高趋势但差异无统计学意义(P>0.05)，艾烟组小鼠血清IL-8含量明显下降(P<0.05)；与香烟组比较，艾烟组小鼠血清IL-8含量显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠血清TNF-α、IL-8含量比较

2.2.3 各组小鼠血清SAA含量比较 各组小鼠血清中SAA的含量由高到低依次是香烟组>艾烟组>模型组>空白组。与空白组比较，香烟组小鼠血清SAA含量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；其余各组之间比较差异均无统计学意义(均均P>0.05)。见表2。

2.2.4 各组小鼠血清CRP含量比较 各组小鼠血清中CRP的含量由高到低依次是香烟组>模型组>艾烟组>空白组，与空白组比较，模型组、香烟组小鼠血清CRP含量均明显升高(P<0.05)，艾烟组差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，香烟组小鼠血清CRP含量有升高趋势但差异无统计学意义(P>0.05)，艾烟组小鼠血清CRP含量有下降趋势但差异无统计学意义(P>0.05)；与香烟组比较，艾烟组小鼠血清CRP含量显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠血清SAA、CRP含量比较

3 讨论

AD的核心病理特征之一是脑内β-淀粉样蛋白异常沉积，而β-淀粉样蛋白是由APP裂解而来[18]。在正常情况下，APP的产生和降解处于一种动态平衡。然而，当APP在体内的代谢出现异常时，β-淀粉样蛋白生成增多而清除率下降，导致β-淀粉样蛋白在脑内大量沉积，诱发神经毒性[19-20]。因此，抑制β-淀粉样蛋白聚集和促进其降解是治疗AD的关键途径。有研究报道，以调节β-淀粉样蛋白生成和清除失衡为主要作用的抗β-淀粉样蛋白药物未能显著改善AD患者学习认知功能，且不良反应明显[21-22]。近年来，有研究发现，艾灸督脉可改善APP/PS1小鼠学习记忆和认知功能，加速β-淀粉样蛋白1-42清除，进而减少β-淀粉样蛋白1-42沉积。本课题组前期以载脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)-/-小鼠为研究对象，观察发现艾烟能够发挥ApoE-/-小鼠的海马CA3区保护作用，减少β-淀粉样蛋白沉积进而提高ApoE-/-小鼠学习记忆能力[23-25]。本研究通过刚果红染色法和电镜观察小鼠海马的组织形态，说明艾烟的确能够有效减少β-淀粉样蛋白在APP/PS1小鼠脑内的沉积，香烟则加重β-淀粉样蛋白的沉积，可能与艾烟的芳香气味作用于嗅觉传导通路的神经递质有关。

神经炎症是目前比较公认的神经退行性疾病的重要生理病理特征。由β-淀粉样蛋白级联机制介导小胶质细胞(Microglia，MG)活化、星形胶质细胞增殖，MG活化后不断分泌TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症介质和活性氮簇、活性氧簇等氧化因子，促炎与抗炎稳态平衡被打破进而造成脑内持续的炎症反应，加剧β-淀粉样蛋白的病理学沉积，造成神经元损伤和大脑记忆认知功能障碍，导致AD发生发展的恶性循环[26-29]。TNF-α是AD最主要的炎症介质之一，与炎症反应过程中的神经元毒性、脑细胞凋亡及认知功能减退密切相关[30]。IL-8是多源性的炎症介质，对中性粒细胞有趋化作用，从而实现对炎症反应的调节，其水平可作为跟踪AD进展的有效生物标志物[31]。SAA和CRP是机体急性反应时产生的高度敏感蛋白，主要由肝细胞产生，由炎症介质IL-6诱导,可调节多种细胞炎症反应，在AD的神经炎症中起着至关重要的作用，二者水平具有显著的相关性，联合检测可提高炎症反应的检出率[32-35]。近期的一项尸检研究显示，与对照组比较，AD合并全身性感染患者脑内TNF-α和IL-8水平显著升高[36]。除了中枢系统的变化外，在AD患者中还观察到外周免疫的促炎变化[37]，实验表明，在APP/PS1小鼠中也观察到外周和中枢炎症反应的变化，提示AD外周和中枢的炎症反应之间存在重要的免疫相关通信[38-39]。因此，检测血清TNF-α、IL-8、SAA、CRP的表达情况可直接反映AD机体的炎症反应程度。本实验结果显示，模型组小鼠血清TNF-α、IL-8、CRP含量明显增高，艾烟能显著降低APP/PS1小鼠血清中TNF-α、IL-8和CRP的含量，香烟的作用则完全相反。本团队前期对ApoE-/-小鼠的研究发现，艾烟可以降低血清中IL-1、IL-6等炎症介质的含量，减轻炎症反应[40]，与本实验结果相一致。说明艾烟能够有效抑制炎症反应，可能通过神经炎症机制在一定程度上改善AD的病理症状。

空气颗粒物污染已日益成为危害人体健康的高风险因素，研究表明暴露于空气污染物与AD等神经退行性疾病风险增加有关[41]。流行病学调查显示，在中国，吸烟是许多省死亡率和伤残调整寿命年的首要危险因素[42]。吸烟已被多数研究证明对AD具有危害性，香烟烟雾的主要成分包括焦油和尼古丁，有部分学者认为尼古丁能够抗炎抗氧化进而改善AD患者的学习认知能力[43]。然而，本研究结果显示香烟会加剧APP/PS1模型小鼠海马的β-淀粉样蛋白沉积，促进神经炎症的发生，表明吸烟可能是影响AD发生发展的危险因素。现代研究通过固相微萃取-气相色谱-质谱联用法对艾烟烟雾进行定性分析，发现艾烟中含有多种复杂成分，其挥发性成分有氨、醇类(乙二醇、戊基丁醇)、脂肪烃、芳香烃、萜类化合物及其氧化物等[44]。有临床调查显示艾烟的暴露对针灸师的呼吸健康无明显影响[45]。从中医的角度来说，“烟熏火燎为之灸”“无烟不成艾，无火不成灸”。表明在中医艾灸疗法过程中，一定浓度的艾烟具备安全性，并且其作用值得重视。本实验中艾烟作为一种独立的干预因素，能够在一定程度上减少AD小鼠海马的β-淀粉样蛋白沉积，抑制炎症反应，进而延缓AD病情发展。

综上所述，本研究发现艾烟能够有效减少APP/PS1模型小鼠海马β-淀粉样蛋白沉积，抑制炎症反应，提示可能与AD神经炎症发病机制相关。艾烟烟雾成分作用于AD相关的起效机制还需要进一步的研究和探索。