胶原小肽铁螯合物纳米脂质体的制备及其在模拟胃肠道中的稳定性研究*

毕佳媛 陈梦倩 吴俊超 龚静静 徐源 胡新裕 林依婷 黄光荣*

（中国计量大学生命科学学院，浙江杭州 310018）

铁是人体需求量最大，也是最容易发生代谢障碍的微量元素。如果机体缺铁，将会引起多种疾病，如缺铁性贫血（Iron Deficiency Anemia，IDA）、不孕不育等，可通过摄入含铁量较高的食物或补铁剂补充人体所缺的铁元素。一般动物来源的血红素铁在人体内的吸收效率高，如牛肉中血红素铁的吸收率为22%，大大高于植物来源的1%～5%，但是血红素铁通常呈红色，添加到食品中会影响产品的颜色甚至改变食品的某些性质，应用受到很大限制。因此，非血红素类蛋白质酶促水解小肽铁螯合物是该领域的研究新动向。有研究表明，以小肽为主要配体的微量元素螯合物能以整体形式被转运，通过聚合作用或者形成离子网络将螯合物截留在凝胶聚合物中，因而更有利于提高微量元素的吸收率。Ashmead 等认为氨基酸和小肽整合盐可能利用氨基酸和小肽的吸收机制。因此，这些适口性好、副作用小、吸收率高的小肽铁螯合物，是一种理想的补铁剂。

胶原蛋白是一种具有生物功能的结构蛋白质，广泛应用于医药、化妆品和食品工业领域。胶原蛋白提取的方法主要有热水提取、酸法提取、碱法提取、盐法提取和酶法提取。鳕鱼是一种优质食物蛋白质来源，在加工过程中会产生大量副产物，其中鳕鱼皮占加工量的7%～8%，而鳕鱼皮干物质中胶原蛋白含量达50%以上，因此，鳕鱼皮是优质胶原蛋白来源。

纳米脂质体是一种类似生物膜结构的双分子层囊泡，因其具有表面可修饰、载药量高等优点而被广泛应用。纳米脂质体包埋技术相较于脂质体包埋技术具有生物相溶性好、生物利用度高、毒性低、成本低等优点，近年来众多研究已将其用于生物活性肽和微量元素的载体。

本研究以鳕鱼皮为研究对象，提取鱼皮胶原蛋白，在胶原酶水解下得到胶原小肽，与铁离子形成螯合物，使用纳米脂质体包埋技术制备纳米脂质体，并通过体外模拟胃肠道稳定性试验探究其对螯合物的保护作用，以期为铁代谢调节控制、铁缺乏疾病的预防等提供一定的理论参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜鳕鱼皮、干鳕鱼皮；胶原酶（125 U/mg）、胃蛋白酶（1:3000）、胰蛋白酶（10 000 U/mg），均为生化纯；氯化亚铁、七水硫酸亚铁、抗坏血酸、盐酸羟胺、邻菲啰啉、菲洛嗪、乙酸铵、卵磷脂、胆固醇、乙醇、氢氧化钠、氯化钠、醋酸、异丙醇、盐酸、磷酸二氢钾等，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

AKTA Pure25 蛋白质纯化仪，美国GE 公司；RV10 旋转蒸发仪，德国IKA 公司；CT14RD 高速冷冻离心机，上海天美科技有限公司；Nano-S90高灵敏纳米粒度分析仪，英国马尔文公司；UV1000 紫外可见分光光度计，上海天美科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 胶原蛋白肽及其铁螯合物的制备

参考柯枭等的制备方法，并略作修改。称取一定量胶原蛋白于锥形瓶中，加入一定体积的去离子水（pH 5.5）溶解，使得底物质量浓度为8 mg/mL，加入胶原酶（酶底物比30 U/mg），置于恒温摇床（33 ℃）中水解80 min，收集酶解液，沸水浴灭酶10 min，冰水冷却，10 000 r/min 离心10 min，取上清液，冷冻干燥得胶原蛋白肽。将其溶于去离子水中配成50 mL 6.7%肽溶液，加入10 mL 1% FeCl2（含1%抗坏血酸），室温下磁力搅拌2 h，添加6 倍体积的无水乙醇洗涤，10 000 r/min 离心10 min，重复洗涤3次，收集沉淀，冷冻干燥得铁螯合物。

1.3.2 水解物分子量分布

用Sephadex G-15 凝胶柱（10 mm × 300 mm）对胶原蛋白肽进行分离，流速0.5 mL/min，检测波长220 nm，以氧化型谷胱甘肽（分子量613）为分子量标准品。

1.3.3 纳米脂质体制备

将卵磷脂和胆固醇溶于30 mL 乙醇中，加热超声溶解，在一定温度下进行旋转蒸发，除去有机溶剂，待瓶壁形成一层致密的薄膜，称取螯合物用30 mL 去离子水溶解，水浴预热后倒入瓶中与膜混合，经过加入水相介质水化30 min，移出溶液，超声10 min，分别过孔径0.45μm 滤膜和0.22μm 滤膜，得纳米脂质体悬浮液。

1.3.4 体外模拟胃肠液消化

根据WANG 等方法，制备人工模拟胃液和人工模拟肠液。分别取6 mg纳米脂质体和螯合物溶液置于120 mL 摸拟胃液中，在37 ℃下磁力搅拌，溶解后采用邻菲罗啉法测定总铁含量。然后分别于0.5h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、4.0 h取样，沸水浴10 min 灭酶，10 000 r/min 离心10 min，以菲洛嗪法测定上清液中游离铁含量。在4 h时用NaOH调pH 值为7 终止反应，转移至肠液中，37 ℃磁力搅拌，接上时间，于4.5 h、5.0 h、5.5 h、6.0 h 取样，沸水浴10 min 灭酶，10 000 r/min 离心10 min，以菲洛嗪法测定上清液中游离铁含量。

1.4 测定方法

1.4.1 总铁含量

采用邻菲罗啉法测定总铁含量。取适量样品溶液于50 mL 容量瓶中，依次加入6 mol/L 盐酸1 mL，10%盐酸羟胺1 mL，0.5%邻菲罗啉2 mL，pH 值4.6乙酸铵缓冲液5 mL，以去离子水稀释至刻度，摇匀，反应15 min，以水为空白对照，在510 nm 处测定吸光度值。用硫酸亚铁为标准品，绘制标准曲线。

1.4.2 铁离子释放率

以菲洛嗪法测定胃肠液稳定性试验中的游离铁离子含量。样品以邻菲罗啉法测定总铁含量，以菲洛嗪法测定游离铁离子含量。菲洛嗪法简要步骤为：取1 mL 样品溶液，加入2 mL 去离子水，用1 mol/L HCl溶液调pH值5.4～6.0，加入0.2 mL 5 mmol/L菲洛嗪溶液，反应30 min，于562 nm 处测定吸光度值，空白组用去离子水代替样品溶液，以硫酸亚铁为标准品，绘制标准曲线。铁离子释放率以游离铁离子占总铁含量的百分比表示。

1.4.3 包封率

取螯合物纳米脂质体混悬液，加入等体积的去离子水，10 000 r/min 离心10 min，取上清液，采用邻菲罗啉法测定铁含量，用空白纳米脂质体为对照，测定510 nm 处的吸光度值，分别记录吸光度值。代入标准曲线，得游离铁离子的质量浓度C1。离心取沉淀，同法测定游离铁离子质量浓度，以空白纳米脂质体为对照。代入标准曲线，得包埋铁离子的质量浓度C2。根据公式得包封率：

1.4.4 纳米脂质体粒径

采用Nano-S90高灵敏纳米粒度分析仪测定。

1.5 数据处理

所有测定均重复3 次，结果以平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 胶原蛋白肽分子量分布

以干鱼皮制备得到的胶原蛋白和以鲜鱼皮制备得到的胶原蛋白，分别用胶原酶水解后得到的肽，经过SepHadex G-15 凝胶柱洗脱分离，分子量分布情况如图1 所示。由图1 可知，干鱼皮的胶原蛋白肽水解组分有3 个吸收峰，鲜鱼皮的胶原蛋白肽水解物有2 个吸收峰。对比干、鲜鱼皮的胶原蛋白肽水解物的吸收峰与氧化型谷胱甘肽（分子量613，保留时间65 min）色谱图，可以看出干、鲜鱼皮胶原蛋白肽的水解物相对分子量均小于1 000，低于613 的占绝大部分，而且鲜鳕鱼皮水解得到的肽相对分子量小于干鱼皮水解肽。因此后续试验均采用鲜鳕鱼皮进行提取。

2.2 纳米脂质体制备条件优化

纳米脂质体技术是一种利用磷脂双分子层生物膜结构的脂质体技术，可以用来包埋生物活性物质，提高其生物利用率。本文采用薄膜分散法制备纳米脂质体，研究了加样量、胆脂比、pH 值和温度等4 个因素对胶原肽螯合铁纳米脂质体包封率的影响，结果分别见图2～图5。

由图2 可知，随着胶原肽铁螯合物加样量（30 mL 体系中）的增加，纳米脂质体的包封率随之增大，当胶原肽铁螯合物的加样量为6 mg 时，包封率达到最高，随着加样量进一步增加，包封率显著降低。因此确定下一步加样量优化范围为5 mg～7 mg。由图3 可知，在胆脂比0.25～0.35 范围内，纳米脂质体的包封率随着胆脂比升高而增大，在胆脂比为0.35 时达到最大，之后开始快速降低，胆脂比为0.35 时最佳。由图4 可知，在pH 值4.0～6.0 范围内，纳米脂质体包封率随pH 值升高而增大，在pH 值为6.0 时达到最大，之后开始降低，这可能是由于胶原肽铁螯合物在弱酸性时与脂质体结合效果较好的原因。由图5 可知，随着制备过程中水合温度的升高，包封率增大，40 ℃时达到最大，当温度超过40 ℃时呈快速下降趋势。温度适当增大有利于脂质体内部胶原肽铁螯合物和磷脂等形成均一稳定的结构，但是温度过高，胶原肽螯合铁纳米脂质体的稳定性降低，包封率有所下降，因此确定40 ℃时为适宜温度。

通过以上单因素试验，初步确定响应面试验的4个因素的中心点值分别为：加样量6 mg，胆脂比0.35，pH 值6.0，温度40 ℃。响应面优化因素水平设计和试验结果如下页表1 所示。用Design-expert 8.0 对结果进行方差分析，结果见表2。结果表明对包封率影响显著因素的有温度（A）、加样量（B）和胆脂比（C），同时各因素间的交互作用并不明显。

表1 纳米脂质体包封率响应面试验结果

表2 响应面法方差分析结果

根据Design-expert 8.0 分析得出螯合的最优条件为：温度39.9 ℃，胆脂比0.366，加样量5.6 mg，pH 值6.0，此条件下包封率为69.033%。同时，在温度40 ℃，胆脂比0.37，加样量5.6 mg，pH 值6.0条件下，做3 次验证试验，平均包封率为70.1%，与预测值比较接近。

2.3 纳米脂质体粒径

对制备得到的纳米脂质体粒径进行测定，空白纳米脂质体平均粒径为138.7 nm，在纳米级范围内粒径分布范围较窄、分布区域比较集中，表明所制备的空白纳米脂质体是以纳米结构体的形式均匀分布。螯合物纳米脂质体平均粒径为192.3 nm，相比于空白脂质体，螯合物的载入增大了粒径值，加宽了粒径分布范围，分布区域较分散，说明螯合物的载入会影响其均匀分布。

2.4 在模拟胃肠液中的稳定性

试验比较了胶原肽铁螯合物及其纳米脂质体在模拟胃液和肠液中的稳定性，结果如图6 所示。从图6 可以看出，相同条件下，胶原肽铁螯合物的铁离子释放率高于胶原肽螯合铁纳米脂质体，也就是说纳米脂质体对胶原肽铁螯合物具有一定保护作用，减缓了其释放速率。同时比较了胶原肽铁螯合物与其他氨基酸铁螯合物（以甘氨酸铁螯合物为对照）在模拟胃液和肠液中的稳定性，试验结果如下页图7 所示。图中0 h～4 h 是在胃液中测得，4 h～6 h是在肠液中测得，即模拟了食物在人体内消化的停留时间。由图7 可知，在0 h～4 h 模拟胃液环境下，胶原肽铁螯合物的铁离子释放最快，甘氨酸螯合铁的铁离子释放最慢，且三者的释放率随时间变化波动不大。在第4 h 转换为模拟肠液环境时，三者的铁离子释放率均急剧增长，这可能是由于pH 值变化导致的。在4 h～6 h内三者的释放率随时间变化波动不大，但是胶原肽铁螯合物纳米脂质体的释放率最低，胶原肽铁螯合物的释放率最高，甘氨酸螯合铁的释放率介于中间，由此进一步看出纳米脂质体更稳定，对螯合物具有保护作用，具有缓释作用。

3 结论

以鲜鱼皮提取的胶原蛋白比干鱼皮提取的胶原蛋白在胶原酶水解后具有更低的分子量。以胶原蛋白肽与亚铁离子螯合，得到胶原蛋白肽铁螯合物。通过单因素和响应面试验优化得到制备胶原蛋白肽铁螯合物纳米脂质体的最佳工艺参数为：温度40 ℃，胆脂比0.37，加样量5.6 mg（30 mL 体系中），pH值6.0，制备得到的螯合物纳米脂质体平均粒径为192.3 nm。模拟胃肠道消化稳定性试验结果表明，纳米脂质体对于肽铁螯合物有较好的保护作用和缓释作用。本研究结果为铁代谢调节控制、铁缺乏疾病的预防等提供了一定的理论参考价值。