广西德保矮马冷冻精液制作与保存

文│邓祝新 王国利 魏莎 李敏玲 许春荣 王英群 韦慧华 李牮伸 邹乐勤 洪绍锋（广西壮族自治区畜禽品种改良站）

当前，世界上的大多数国家都在建立畜禽基因库，畜禽基因库中有精液、胚胎、体细胞等遗传材料。家畜精液保存目的是将优良品种（包括地方优良品种）的精液进行冷冻，长期保存，这对保种和未来育种十分重要。家畜精液保存技术是随着人工授精技术的推广使用而产生的，原理是通过降低或抑制精子新陈代谢达到延长精子寿命的目的。家畜冷冻精液发展迅速，特别在牛方面成效显著。广西壮族自治区2022年开始进行马冷冻精液保存研究，目前还处在试验改进阶段。本研究旨在寻求能确保获得较好冻后存活率的有关稀释液配比和降温速度等一些因素的“最优”组合。

广西德保矮马研究所位于广西百色市德保县境内，是现存、惟一的德保矮马保种场。德保矮马是我国最矮的地方马种之一，也是世界稀有珍贵马种，据文献记载，德保矮马是“吉祥马”的象征。德保矮马身高76～104厘米，具有性情温顺、体型矮小、体质结实、体小力大、适应性强、耐粗饲、抗病力强等优良特性，德保矮马用途广泛，可用于使役、骑乘、观赏和科研等。目前，纯种德保矮马数量较少，必须立即开展保种工作，采集德保矮马的遗传材料，包括精液、胚胎、体细胞等。一直使用熏蒸冷冻法制作德保矮马冷冻精液，导致德保矮马冻精质量一直不够理想。现在笔者针对如何提升德保矮马冷冻精液质量做了更深一步研究。采用法国卡苏IMV公司提供的冷冻精液制作方案进行德保矮马冷冻精液生产。

一、采精种公马的选择

按照《NY/T 1900-2010畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范》，从保种场中不少于6个家系中挑选10匹公马。公马要求符合品种特征、特性，系谱清楚，三代以内无亲缘关系，体况健康，无传染性疾病和遗传疾病。

二、采精前的准备

假阴道的准备：使用法国卡苏公司生产的整套采精设备，包括采精筒、内胆、皮外套、集精杯、专用塑料内胎、漏斗。采精前向假阴道内胎夹层灌入3500～4000毫升（45±2）℃热水，而后在假阴道入口前l／2段用玻璃棒均匀涂抹润滑剂（液体石蜡油），无需打气。灌水量视公马阴茎的粗细、长短而调整。采精过程中内胎温度为（45±2）℃。

台马的准备：选择与种公马相匹配、健康温顺的母马，将发情母马牵引到采精棚内保定好，依次用2%来苏尔液和清水清洗后躯和外阴部，用干净毛巾擦干，随后将公马牵引到母马背后准备采精。

三、采精方法

将种公马牵至采精场，以台马刺激其性欲。采精时，采精员右手持假阴道把柄并靠在右臂肘处，公马爬跨时立即站于台马右侧，左手辅助将阴茎导入假阴道内；公马射精后将假阴道的集精杯端放低并打开活塞放气，充分排精后，缓慢将假阴道竖起并移开，迅速送检。

四、采精频率

成年公马每周采精1次（每次采精需要爬跨3次）；青年公马每周l～2次（训练青年公马形成采精条件反射）。

五、精液品质检查

取下集精杯，用马精液专用过滤纸做成漏斗状，将新鲜矮马精液注入漏斗中，过滤出干净的原精，收集到一个100毫升的三角烧杯内，在室温环境下进行检查。

1.外观检查。射精量：用量筒测量精液量。色泽：正常情况下为淡乳白色或灰白色，带有淡绿色、淡红色、黄色、红褐色等异常颜色的精液应废弃。气味：新鲜精液略有腥味，气味异常的应废弃。

2.显微镜检查。精子活率评定：检查时用移液枪取10微升，滴在载玻片上加盖玻片，在400～600倍显微镜下观察，每个滴片不得少于3个视野，求其活力的平均值。显微镜载物台温度应保持37～38℃。精子活率＜ 0.7的精液应废弃。

精子密度检查：种公马每次采精应测定1次精子密度。血细胞计数器测定法：用白细胞细管吸取一定的原精，再吸取3%氯化钠溶液将原精稀释10倍，混合均匀后，用细胞计数器在显微镜下放大400倍计数，计算每毫升精液中的精子数。

3.精液品质检查记录。精液品质检查记录表包括种公马马场名称、种公马号、年龄、品种、毛色特征、采精日期、采精量（毫升）、颜色、气味、pH、密度（亿个/毫升）、活率、稀释液种类、稀释后活力、采精员、检测员及备注。

六、鲜精的稀释与平衡

1.鲜精的第一次稀释与平衡。鲜精密度测量：使用卡苏公司生产的家畜精子专用密度仪（ACCUREAD），取40微升原精，注入2.4毫升生理盐水中，混合摇匀，进行密度测定，并做好数据记录。

鲜精第一次稀释方法：使用卡苏公司生产的马专用稀释液（离心稀释液INRA 96），等温加注，与原精按1∶1的比例混合均匀，然后在37℃的温水中水浴，等待进行离心之前的配平。

2.鲜精的离心。将第一次稀释后的原精液用50毫升的离心管分装，配平至2～4管，每管加入1～2毫升的离心缓冲剂。注入离心缓冲剂的方法：首先取出一管精液，将一根吸管直插到精液底部，然后用注射器抽取1～2毫升的离心缓冲剂（MAXI FREEZE ），从吸管顶部注入，直达精液底部，不能晃动吸管，让缓冲剂停留在底部，然后抽出吸管即可完成一份。以此类推，逐一加完其他管子。之后进行离心，2500转20分钟即可。取出离心管，去掉上清液部分，直至保留精液层为止，再用无菌一次性注射器，垂直插到精液底部，把离心缓冲剂抽取干净，最后只剩下离心后的精子层。

3.鲜精的第二次稀释。具体计算方法如下：

鲜精密度×精液体积＝精子总数

精子总数/每管精子总数＝分装管数

分装管数×每管体积＝加入冷冻液与抗冻剂的体积

根据计算结果，分别加入冷冻稀释液（INRA Freeze）与抗冻剂。一边稀释，一边镜检观察鲜精的密度，采取理论与经验相结合的方法进行稀释。一般情况下，实际量要少于理论值。

稀释要求：

（1）灌装使用0.5毫升的细管;

（2）5000万有效精子数/支（0.5毫升）;

（3）1.5亿总精子数/支（0.5毫升）;

（4）鲜精的活力达0.7以上为符合冷冻制作要求。

4.鲜精的平衡与分装。在常温环境下，把德保矮马鲜精液稀释后水浴，然后静置于4℃的恒温冰箱内。等待90分钟后，在4℃的平衡柜里进行分装。分装要求：使用0.5毫升的细管进行精液分装、封口。并且在细管上打印产地、品种标识和日期。最后在细管冻精包装的时候要注明标签、专人保管、存放管理。

七、冷冻精液的制作

冷冻制作使用了法国卡苏公司的精子冷冻仪设备。将分装好的细管精液排在冷冻专用架子上，迅速放置于冷冻柜内进行冷冻制作。在电脑软件中选择马冻精制作专用程序，打开程序进行冷冻过程。整个冷冻时间为5分钟左右，以60℃/分钟的速度降温，把细管精液从4℃快速冷冻到-140℃。产品即可成型，然后打开冷冻仪，把细管精液从里面快速取出，瞬间完全浸泡到液氮里，直至液氮沸腾消失。此时，完成冷冻制作过程。

八、解冻与镜检

首先，用镊子从液氮中取出冻精，空气浴2～3秒。然后迅速完全浸泡到38.5℃的恒温水浴锅中，摇晃解冻1分钟，取出、剪管，将全部精液挤入到指型管中，水浴。在电子显微镜下镜检：用移液枪吸取10微升滴在载玻片上，置于恒温板上进行镜检。活力等于或大于0.3的为合格冻精。

九、精液冷冻保存

按照《NY/T 1900-2010畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范》，对选定德保矮马精液进行保存。每匹公马保存冻精不少于300支，冷冻精液质量要求：剂量≥0.4毫升，精子活力≥0.3，直线前进运动精子数≥5.0×107，精子畸形率≤25%，细菌数≤800个。细管标记：以汉语拼音缩写标明公马品种、公马号、生产日期（如德保矮马5号2021年12月31日生产，印字为：DBAM 5 2021 12 31）。标签要求标记如下内容：品种、个体号、生产日期、数量、解冻后精子的活力、袋号。