阴地蕨黄酮类成分提取分离、鉴定及抗氧化活性研究进展*

李俊雅 综述，王 姣，李 君 审校

(湘潭医卫职业技术学院，湖南 湘潭 411102)

阴地蕨为阴地蕨科阴地蕨属多年生草本植物，别称小春花、一朵云。以全草入药，广泛分布于贵州、云南、湖南、湖北、广西等地区[1-4]。阴地蕨含有总黄酮、多糖、皂苷、酚类等化学成分。黄酮类成分成为阴地蕨的主要活性成分[5]。黄酮是一类具有抗氧化活性的化合物,被认为是促进健康和预防疾病的膳食补充剂[6]。阴地蕨黄酮类成分被用于医药、保健食品及化妆品等领域[7-9]。本文通过对阴地蕨黄酮类成分的提取分离、鉴定及抗氧化活性进行综述，研究民族医药资源，发现更多民族医药的药用价值，弘扬民族医药事业。同时为开发阴地蕨相关药品、食品等相关产业提供理论基础。

1 阴地蕨黄酮的提取方法

1.1溶剂提取法 黄酮类化合物传统的提取工艺多为溶剂提取法，一般多采用水或乙醇作为溶剂进行提取。水作为溶剂提取时，很容易出现提取物发霉变质，一般不推荐使用。乙醇的价格相对便宜，容易回收，提取后处理方便，提取的含量高，同时不会出现提取液发霉变质的问题，所以工业化大生产中多采用乙醇作为溶剂进行黄酮类成分的提取[10]。

郑小卫等[11]根据中药提取的因素水平设计了正交试验，对比不同浓度乙醇对总黄酮的提取效率，并最终确定阴地蕨总黄酮的提取方法为6倍量70%乙醇提取3次，每次2 h。经过工艺验证试验表明：提取物中总黄酮含量达4.14 mg/g，转移率达90%以上。

周施雨[12]采用75%乙醇作为溶剂，并采用加热的方法开对阴地蕨总黄酮成分的提取分离，确定了提取阴地蕨黄酮的提取工艺方法。并同时对阴地蕨地上和地下部分总黄酮的含量进行了进一步的研究和探讨，发现阴地蕨地上部分黄酮含量高于地下部分黄酮含量，为阴地蕨黄酮成分有效部位的采收确立了理论依据。

1.2超声波辅助提取法 超声波辅助提取法是根据空化作用在溶剂中局部形成高温高压，通过破坏植物的细胞，使样品内部变得疏松，从而增强溶剂穿透能力，提高有效成分的提取率，还可以减少实验溶剂的消耗[13]。

曹剑锋等[14]通过单因素试验和正交试验，利用超声波辅助提取技术，以总黄酮提取率作为考察指标，把影响阴地蕨黄酮提取率的主要因素乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度4个因素作为单因素试验对象，确定了阴地蕨中黄酮类成分的最佳提取工艺。

徐连巧等[15]和曹剑锋等[16]以总黄酮提取率为考察指标，利用单因素试验结合响应面Box-Benhnken试验设计方法，考察不同影响因素对阴地蕨黄酮提取工艺的影响，确立优化阴地蕨根黄酮提取工艺。阴地蕨粉用73%乙醇溶解后，在71 ℃超声提取73 min，黄酮提取得率为3.429 9 mg/g。

1.3不同提取方法的比较 上述文献中比较阴地蕨黄酮类提取工艺方法，单纯采用乙醇作为溶剂得到黄酮含量较低，以乙醇为溶剂，利用超声波辅助技术，可大大提高黄酮的提取率。结合响应面试验设计方法，更能全面确定最佳影响因素的条件。目前,阴地蕨黄酮类成分提取工艺方法相对较少，可进一步研究微波辅助、酶辅助等方法或手段对提取工艺的影响。

2 阴地蕨黄酮的分离纯化方法

2.1大孔树脂分离法 大孔吸附树脂是一类不含交换基团且有大孔结构的高分子吸附树脂，其结构为大孔网状，具有较大的比表面积，因而具有较强的吸附性和分子筛分离作用，能够对中药提取物的有效成分或有效部位进行提取分离，是20世纪发展起来的新型有机高聚物吸附剂，常用于中药有效成分的分离[17]。

郑小卫等[11]以阴地蕨总黄酮为指标，对阴地蕨黄酮的吸附能力和解吸附能力作为考察对象，优选不同型号大孔吸附树脂确定阴地蕨黄酮类成分的分离工艺。从样品pH值、样品液浓度、洗脱液用量和洗脱液浓度等影响阴地蕨黄酮类成分分离的主要因素采用单因素比较法，建立了阴地蕨总黄酮的大孔树脂分离工艺，获得了较高的黄酮回收率。当上样液pH值为5、浓度为1.22 mg/mL时吸附量最大，洗脱剂70%乙醇时得率最高，达75%以上。

2.2聚酰胺树脂分离法 郑小卫等[11]对2种聚酰胺树脂进行了静态吸附量与解吸附率的考察，结果表明,100-200型聚酰胺树脂对小春花黄酮的吸附和解吸附率优于60～80型聚酰胺树脂。阴地蕨总黄酮的聚酰胺树脂分离工艺为样品液浓度为1.18 mg/mL，用70%乙醇4BV洗脱，总黄酮得率为76.69%。

2.3柱色谱分离法 羊波等[18]利用反相硅胶柱色谱法、Sephadex LH-20凝胶柱色谱法等方法对阴地蕨进行分离纯化，共分离出阴地蕨醋酸乙酯部位分离得到10个黄酮类化合物，并通过理化性质和波谱数据鉴定化合物的结构。

2.4高速逆流色谱分离技术(HSCCC) HSCCC是一种不用任何固态载体或支撑体的液液分配色谱技术。其分离原理为两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，通过两相溶剂连续有序的重复混合实现高效分离，是近几年发展起来的一种连续高效的液-液分配色谱分离技术[19-20]。

吴大同等[21]研究认为，黄酮化合物的分配系数会随着酸度的变化而变化。根据此原理，构建了动态可变pH高速逆流色谱，并将其用于阴地蕨提取物的分离纯化。以三元溶剂(正丁醇、乙酸乙酯、水)组成两相溶剂体系，前80 min以硫酸铵为流动相，80 min后加入一定量的醋酸为流动相。最终分离提纯了阴地蕨中5种黄酮糖苷类化合物，并获得了较好的得率。

2.5不同分离方法的比较 柱色谱分离方法需要反复上柱，实际操作过程繁琐，多适合实验室研究，工业化大生产不太适应。高速逆流色谱适应性好、回收率高、分离效率高，可用于天然药物中有效成分的分离。但目前的HSCCC不够成熟稳定，较佳的溶剂系统需要多次实验才能筛选出来。HSCCC发展成为一种更加成熟的可产业化的高效分离技术需要进一步更多的稳定性试验研究。大孔树脂技术可以提高黄酮类化合物得率和纯度。目前，对于阴地蕨黄酮成分的分离应用广泛，可作为目前阴地蕨黄酮类成分首选的分离技术。

3 阴地蕨黄酮的鉴定方法

阴地蕨已有的研究报道表明,阴地蕨黄酮类成分主要为槲皮素、木犀草素、山奈酚等[22-24]。

3.1紫外分光光度法 紫外分光光度法具有操作简单、仪器费用少、分析速度快，灵敏度高等特点，常作为药品鉴别的方法。

辛文秀等[25]利用黄酮类成分在碱性条件下能与硝酸铝形成红色螯合物的特性，以槲皮素为对照品，于507 nm下测定吸光度值，从而计算总黄酮的含量。方法学研究结果显示，槲皮素浓度在30.23～181.40 μg/mL内呈良好的线性关系(R2=0.998 4)，并且具有很好的准确性、精密度及稳定性，适用于阴地蕨总黄酮的含量测定。

3.2薄层色谱法 陈敏等[26]建立了阴地蕨制剂小春花口服液中黄酮类主要有效成分木犀草素的定性鉴别方法，以硅胶G-0.5%CMC-Na板作为固定相，以苯-乙酸乙酯-甲酸(8∶2∶0.5)作为展开剂。阴地蕨制剂中与木犀草素对照品对应位置处呈较明显的暗斑，表明供试品中含木犀草素。

3.3高效液相色谱法 陈敏等[26]建立了高效液相色谱法测定阴地蕨制剂小春花口服液中木犀草素含量，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂作为固定性；用0.4%磷酸缓冲液(pH=3)-甲醇(50∶50)组成流动相，355 nm确定紫外检测波长。结果小春花口服液中主要阴地蕨黄酮有效成分保留时间为15 min，并与供试品中其他成分色谱蜂较好分离。该质量标准方法的确立，也为阴地蕨制剂小春花口服液中主要成分的质量评价提供了依据。

辛文秀等[25]研究发现，阴地蕨中黄酮类成分主要是槲皮素和山奈酚，并以此成分作为阴地蕨药材的质量控制含量测定的指标。建立了高效液相色谱法同时测定阴地蕨药材中槲皮素和山奈酚含量的方法。采用YMC ODS柱色谱柱，甲醇-0.4%磷酸(52∶48)为流动相，检测波长用为360 nm，采用二极管阵列检测器，在此色谱条件下阴地蕨黄酮类主成分槲皮素、山奈酚色谱峰峰形好、分离度高。理论塔板数均大于10 000，分离度均大于1.5。

本课题前期研究[27]建立了高效液相色谱法测定不同产地、不同采收期、不同部位阴地蕨药材中木犀草素的含量。同时研究发现阴地蕨黄酮类成分木犀草素的含量每年8月份药材各部位含量最高；不同部位木犀草素的含量由高到低的顺序为：叶、茎、根；每年不同生长时期、不同部位呈现明显的变化规律。为阴地蕨生物特性的形成及阴地蕨药材采收期提供一定的科学依据。

3.4联用技术 何可群[28]通过高效液相色谱-质谱串联(HPLC-MS/MS)法，通过获得分子量信息,鉴定阴地蕨中山奈酚成分，然后进一步与标准样品保留时间对比，确定阴地蕨中山奈酚及槲皮素成分。高效液相色谱仪采用Agilent1200LC及质谱仪为API3200 QTRAP MS/MS，色谱柱为Eeilipse plus C18色谱柱，流动相采用甲醇-0.4%甲酸溶液(45∶55)，检测波长为360 nm鉴定阴地蕨中黄酮类有效成分。样品中特征峰m/z301.0[M+H]+峰及m/z287.1[M+H]+，与槲皮素及山奈酚对照品特征峰具有高度相似度，证实阴地蕨中含有丰富的槲皮素和山奈酚成分。

3.5不同鉴定方法的比较 随着阴地蕨药材资源开发和研究，阴地蕨成分的检测和鉴定方法已从早期的紫外分光光度法、薄层色谱法，发展到目前广泛使用的液相色谱法，以及高效液相色谱-质谱联用技术。其测定成分也已从总成分总黄酮到具体成分木犀草素、槲皮素、山奈酚等的研究。分离、鉴定出阴地蕨总黄酮更多的成分，对于阴地蕨药材资源开发，发现研究阴地蕨更多的药效成分和生物学作用及建立与药效相关的质量控制标准具有重要意义。

4 阴地蕨黄酮类抗氧化活性研究

4.1直接清除活性氧自由基 黎远军等[30]利用消除DPPH、ABTS自由基的能力和还原能力作为测定指标测定了阴地蕨的乙醇提取物总黄酮类成分的抗氧化活性。结果表明，阴地蕨总黄酮能直接消除DPPH、ABTS产生的自由基，有较强的抗氧化能力。且阴地蕨抗氧化活性与总黄酮含量存在浓度依赖。

曹剑锋等[14]考察了阴地蕨黄酮提取液对羟基自由基、超氧阴离子自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的清除能力，研究阴地蕨黄酮成分的抗氧化作用，并通过单因素正交试验确立了阴地蕨抗氧化活性成分的最佳提取工艺。结果表明阴地蕨根总黄酮提取液具有清除羟基自由基、超氧阴离子自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的作用，证实阴地蕨黄酮具有明显的抗氧化活性。并进一步试验研究发现阴地蕨根中黄酮成分抗氧化活性成分较高，阴地蕨根中的黄酮成分是一种良好的抗氧化成分。

4.2抑制油脂过氧化反应 徐连巧等[15]和曹剑锋等[16]以过氧化值(POV)为指标，采用Schaal烘箱法研究了阴地蕨总黄酮对油脂的抗氧化性能。结果表明，油脂自氧化反应程度随烘箱放置时间的延长而加大，在相同的烘箱放置时间段，植物油的POV远比动物油的POV大，表明植物油受到相同烘箱热能时更容易发生自氧化反应。阴地蕨黄酮提取液可以不同程度地降低动物油和植物油的过氧化值。证实阴地蕨总黄酮对动物油和植物油均有优良的抗氧化效果，阴地蕨黄酮提取液对动物油抗氧化作用更为显著，并且其抗氧化作用效果呈剂量相关性。阴地蕨抑制油脂抗氧化反应的特点，适合作为高温烘焙油炸食品类的抗氧化添加剂。

4.3增强抗氧化酶的活性 人类老龄化相关影响因素研究发现，人体内的过氧化物尤其过氧化阴离子自由基，因为不及时清除积聚体内会成为人体的“垃圾”，甚至会直接攻击杀害人体重要的蛋白质、核酸和内脏器官，导致机体实质性组织器官损伤破坏。因此，体内抗氧化系统显得非常重要。人体内的抗氧化系统主要由超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等一系列酶组成。

其中SOD是人体内的一种最重要的细胞保护酶，能有效地抵抗过氧化阴离子自由基的功能。SOD作为细胞保护酶的原理是，其能促使氧自由基转化成过氧化氢，从而清除炎症过程中伴随产生的过氧化物游离基，保护细胞的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。因此，SOD酶活性的强弱常作为抗氧化能力的关键评价指标。GSH-Px是机体内一种过氧化物分解酶，能迅速促进过氧化氢的分解，消除过氧化氢，在机体氧化和抗氧化平衡中发挥作用。体外加入外源性抗氧化剂可以提高机体抗氧化酶的活性，间接增强对过氧化阴离子自由基的清除作用，从而抵抗氧化损伤。近年来，已有大量关于中药增强抗氧化酶活性的相关研究报道。

黎远军等[30]参照大鼠训练方案，对运动组和运动加药组大鼠先在跑台进行适应性训练，研究了阴地蕨提取物对运动训练大鼠肾脏氧化酶活性的影响，实验结果显示，运动组大鼠经过了长时间较大强度的运动后，肾脏组织SOD活性降低，运动加药组大鼠SOD和GSH-Px活性比单纯运动组升高，证实阴地蕨提取物能提高抗氧化酶的抗氧化作用，阴地蕨提取物所含抗氧化剂能保护抗氧化酶的结构不受破坏，阴地蕨提取物对大鼠肾脏组织具有一定的抗氧化能力，能减轻机体氧化损伤程度，维护机体组织正常的结构、生理功能和运动功能。

周云等[31]研究发现，阴地蕨提取物提高了小鼠的力竭运动时间，缓解了小鼠运动后的疲劳感，增强了运动后小鼠体内的SOD活力，证明阴地蕨具有一定的抗氧化能力。为阴地蕨药用价值的开发提供了有力保障。

阴地蕨黄酮作为抗氧化活性物质，具有良好的抗氧化阴离子能力，将其抗氧化活性物质研究利用，开发新的食品药品抗氧化剂，对于食品药品添加剂、健康追求具有重要意义。对于阴地蕨中的抗氧化活性物质，目前对其研究主要集中在总成分的提取、生物活性考察等方面，还需进一步深入研究单一成分抗氧化活性能力及作用机制和代谢机制研究。

5 结语与展望

本文介绍了阴地蕨黄酮的提取分离、鉴定及抗氧化活性的研究进展。为阴地蕨药用价值的开发提供了有力保障，同时也为开发治疗以抗氧化机制为病基的疾病及成方制剂提供依据。

阴地蕨作为我国少数民族地区的民间药，我国的民族药，近几年，对于阴地蕨黄酮成分提取分离的研究取得了一定的进展，但适合工业化大生产的提取工艺尚需进一步深入研究。阴地蕨黄酮类成分抗氧化活性的实验室研究较多，但开发出来具有抗氧化活性的阴地蕨制剂较少。对于阴地蕨资源的开发还有很大的发展空间，未来将进一步研究阴地蕨成分及制剂在医药、食品、化妆品等各领域的价值。