循环肿瘤DNA在卵巢癌诊断和治疗中的应用

孙玉莹，段 微

(首都医科大学附属北京妇产医院妇科肿瘤，北京 100010)

1 卵巢癌的诊治现状

妇科恶性肿瘤中卵巢癌的死亡率最高。由于缺乏有效的筛查和检测工具，加之早期缺乏临床症状，70%的卵巢癌患者发现时已处于晚期(Ⅲ～Ⅳ期)，且70%的晚期上皮性卵巢癌患者会在5年内复发。卵巢癌早期诊断治疗更有效，预后也更好，I期卵巢癌5年生存率可达90%，Ⅱ期卵巢癌5年生存率为70%。但是，大多数病例直到癌症扩散后才被发现，导致5年生存率不到30%[1]。在卵巢癌不同阶段，治疗方法主要有卵巢癌减灭手术、化疗、激素或靶向治疗，但相当一部分卵巢癌手术看似达到无肿瘤细胞残存状态(R0)，并化疗至完全缓解(CR)，实际上仍存在微小残留病灶或已出现隐匿性微小转移。如果在卵巢癌早期作出诊断、治疗早期预测治疗疗效以及疾病复发早期发现，将大大提高患者生存率，或个性化制定治疗方案。

传统卵巢癌的诊断筛查方法包括常规组织活检、经阴道超声(TVUS)、计算机断层扫描(CT)、正电子发射断层扫描(PET)以及肿瘤抗原CA125检测。影像学手段能帮助识别卵巢及其他部位的肿瘤组织，但无法提供明确的诊断，不能准确进行良、恶性肿瘤的鉴别诊断，且对于病灶较小的肿瘤组织无法精准的检测。组织活检的有创性以及肿瘤组织的异质性也阻碍了组织活检的发展[2]。目前CA125是卵巢癌的特异性生物标记物，也是临床监测的重要参考标准。CA125在良性疾病及其他恶性肿瘤中表达升高，因此特异性有限，因此寻找更可靠的卵巢癌筛查和诊疗标志物尤为迫切。

2 ctDNA的优势

过去几十年，越来越多的研究表明了液体活检技术在肿瘤筛查和诊疗中的应用潜力[3]。癌症是一种与基因组改变相关的分子疾病，由于基因突变检测技术灵敏度大大提高，血液中循环的细胞DNA中可识别出癌细胞或癌组织，这就是液体活检。美国国家癌症研究所将液体活检定义为“对血液样本进行的检测，以寻找血液中循环的肿瘤细胞或血液中肿瘤细胞的DNA片段”。肿瘤患者外周血中的循环游离DNA(circulating-free DNA，cfDNA)来自多种细胞，包括癌细胞，肿瘤微环境的其他细胞，非肿瘤细胞(如造血干细胞，肌肉细胞、上皮细胞)等[4]。肿瘤细胞来源的DNA片段称为ctDNA。ctDNA除存在于外周血，也存在于其他体液，如腹水、乳汁、淋巴液、腹膜液、腹腔灌洗液、胃液、脑脊液等样本中。相比于肿瘤组织活检检测，ctDNA作为肿瘤诊疗的潜在生物标记物有以下优势[1]：(1)微创性。肿瘤组织活检标本的获取可能存在巨大手术风险，相比之下，ctDNA检测创伤较小。研究指出，在胰腺癌(高达75%)、卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、甲状腺癌、肝癌、胃食管癌和黑色素瘤以及原发中枢神经系统肿瘤(高达50%)、肾癌、前列腺癌中均检测到ctDNA[5]。其中，在高级别浆液性卵巢癌中，TP53突变率高达90%，ctDNA检出率约为75%～100%，具有重要研究价值[6],BRCA1/2检出率为25%，也有一定意义。(2)实时性。对于部分晚期或复发患者，很难取到组织标本进行检测，而ctDNA检测可实时反映患者体内的肿瘤突变及肿瘤负荷，为患者的个性化诊疗提供更多机会。研究表明，ctDNA的半衰期约为16min至2h，因此ctDNA有望作为肿瘤实时状态的监测，如血浆ctDNA可预测60%的早期直肠癌，且发现ctDNA数量与肿瘤体积相关[1]。(3)无空间异质性。肿瘤是一种异质性较高的疾病，只通过部分肿瘤组织的检测可能漏检重要变异信息。ctDNA检测能更全面地反映体内所有肿瘤病灶(包括原发灶、转移灶)的分子异常情况。大量研究显示，ctDNA用于肺癌的常规管理，以监测克隆进化和识别使用酪氨酸激酶抑制剂耐药的患者。随着ctDNA检测技术的快速发展，其在肿瘤的全程诊疗管理中也发挥着越来越重要的作用[3]。

3 ctDNA在卵巢癌诊治中的应用

3.1 ctDNA在卵巢癌早筛早检中的应用 目前在卵巢癌早期诊断中，临床最常用的是CA125、经阴道超声及其他辅助检查的联合。卵巢癌早期病灶太小,血液中CA125水平并不升高，约有50%的I期卵巢癌患者CA125处于正常水平。且CA125可在其他良性疾病，如子宫内膜异位症、盆腔炎性疾病中升高。部分卵巢癌起源于输卵管，但由于输卵管常显示不清，CA125联合TVUS对早期卵巢癌的检出率并不高。因此，CA125作为卵巢癌诊断的肿瘤标志物缺乏特异性[7]。

研究发现，血浆ctDNA具有作为癌症微创诊断工具的潜力，特别是针对高级别浆液性卵巢癌(high grade serous ovarian carcinoma,HGSOC)。TCGA数据显示，约90%的HGSOC患者具有TP53突变。既往研究表明，ctDNA检测TP53突变具有>75%的灵敏度和>80%的特异性。也有研究基于ctDNA的拷贝数变异辅助诊断卵巢癌，相比TP53突变，灵敏度略有下降[8]。除外周血ctDNA检测外，近年也有研究指出，腹水也可进行ctDNA突变检测。Han等选取了10例EOC患者，9例患者的肿瘤组织和腹水ctDNA中均存在体细胞突变，证实了这种突变的一致性。因此,血浆ctDNA与CA125联合检测可提高卵巢癌早期诊断的敏感性,且腹水ctDNA可能比血浆ctDNA更适用于识别卵巢癌的突变情况并协助制定治疗策略。此外发现，连续血浆样本中提取的ctDNA与EOC进展、复发时间相似，比CA125更快[9]。然而，TP53功能性失活突变及拷贝数变化是多种实体瘤常见的分子异常事件，当TP53突变时，仍需结合其他临床症状进行卵巢癌的综合诊断。

近几年，随着ctDNA甲基化技术的开发和应用，目前在肿瘤早筛中有较大潜力。2017年Widschwendter等通过对699例肿瘤患者和非肿瘤患者组织的甲基化状态进行分析，发现了3个DNA甲基化标志物用于区分肿瘤患者和健康/良性肿瘤患者，灵敏度和特异性分别为41.4%和90.7%。通过化疗后ctDNA甲基化状态的检测，发现ctDNA甲基化标志物能正确识别78%的化疗响应和86%的无响应患者，优于CA125(35IU/mL)的监测能力(20%和75%)[10]。2020年Liu等探索了基于cfDNA甲基化特征预测多种肿瘤以及进行肿瘤溯源的可行性。研究共纳入6689例参与者(包含2482例肿瘤患者以及4207例非肿瘤患者)，结果显示，验证组中cfDNA甲基化在预测12种肿瘤(包含卵巢癌)中的特异性为99.3%，Ⅰ～Ⅲ期肿瘤的灵敏度为67.3%。通过cfDNA甲基化进行肿瘤发生部位溯源准确率可达93%，其中进行卵巢癌肿瘤溯源在训练组和验证组中的准确性分别为96%和100%[11]。通过DNA甲基化进行肿瘤预测后续有待前瞻性的验证结果。此外，ctDNA检测还可与多种其他生物标志物联合使用，如CA125、表观遗传标记物、循环肿瘤RNA、核小体、外泌体和相关免疫标记物等，从而成为早期癌症检测分析的关键组成部分，而且更适用于目前尚未使用ctDNA筛查的癌症，如卵巢癌、胰腺癌和胃癌等[6]。综上，ctDNA是一种可行的卵巢癌诊断性生物标志物。

3.2 ctDNA在患者治疗中的应用 如果能在卵巢癌治疗的早期阶段预测治疗疗效，患者可选择更适当的治疗方案，特别是对化疗方案的选择。因此，ctDNA检测方法可能彻底改变现有的卵巢癌管理方案。

3.2.1 ctDNA检测指导晚期患者精准治疗 Oikkonen等分析12例高级别浆液性卵巢癌患者治疗前、治疗期间和治疗后的78个血浆ctDNA样本，结果显示，ctDNA和肿瘤样本的突变和拷贝数改变具有很好的一致性，并在7例患者(58%)中检测到与临床可用药物相关的改变,证明可使用ctDNA指导临床治疗。此外，该研究结果还显示,纵向ctDNA样本可用于识别第一个化疗周期后反应较差的患者。因此纵向ctDNA取样可用于监测对一线治疗的反应，并识别HGSOC中反应不良的患者[12]。Noguchi等[13]研究中，检测了51例不同组织学类型卵巢癌患者血浆中的ctDNA基因突变谱，发现94%患者有一个或多个非同义体细胞突变，其中最常见的是高级别浆液性卵巢癌患者中的TP53基因突变。分析ctDNA与临床病理类型及预后的相关性，结果显示，ctDNA浓度较高时，患者的无进展生存期较差；使用ctDNA可识别个体卵巢癌患者的临床基因组图谱，可作为一个有用的预后指标，因此基于ctDNA的基因图谱可能有助于制定个性化的治疗策略。此外，还有研究[14]收集了44例妇科癌症患者在手术期间和整个治疗过程中的肿瘤组织和血清样本(包括22例卵巢癌，17例子宫体癌，1例腹膜癌，3例输卵管癌，1例同时存在输卵管癌和子宫癌)，其中93.8%的患者检测到ctDNA，且ctDNA水平与血清CA125和CT扫描结果高度相关。相关研究[15]选取了105例卵巢、子宫、宫颈、外阴阴道和不明的妇科原发性肿瘤患者的血浆和组织，通过实验分析得出结论，较高的ctDNA最大突变等位基因频率与总生存率较差相关，与ctDNA改变相匹配的治疗与改善的总生存率独立相关。组织和ctDNA基因组结果有较高的一致性(其中大多数卵巢癌和子宫癌86%为高级别；34%的卵巢癌有BRCA改变，22%为铂敏感)。以上研究均显示了组织和ctDNA基因组结果有较高的一致性。因此ctDNA检测可应用于妇科癌症患者的预后和个体化治疗中。此外，研究还表明，在妇科癌症中应用ctDNA相对于目前使用的血清和影像学检查，更能动态地预测治疗反应。

3.2.2 ctDNA动态监测提示卵巢癌治疗疗效和药物耐药机制与预后 目前大部分研究均显示，体细胞TP53突变是高级别浆液性卵巢癌的一个特征性发现。Kim等[16]研究中，选取61例HGSOC患者的103例肿瘤组织进行直接测序分析，结果显示67.2%的患者有TP53突变。并且所有患者的体细胞突变均发生在浆细胞游离DNA。对诊断为HGSOC和TP53突变的患者，根据疗程随访ctDNA、CA125和CT，ctDNA显示了作为肿瘤特异性治疗反应监测的生物标志物的潜力。治疗后3个月的TP53突变的患者ctDNA水平比CA125具有显著的预测效果。此外，PIK3CA和KRAS已被证实是上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)中最常见的突变基因[17]，它们的突变已被识别出来，可进行高度敏感分析。上述研究筛选了306例患有PIK3CA或KRAS体细胞突变的卵巢癌患者。其中85例EOC患者存在体细胞PIK3CA和(或)KRAS突变，随后使用血浆中的液滴数字聚合酶链反应分析相应的突变。ctDNA在EOC患者中的检出率为27%。其中晚期患者和腹膜细胞学阳性患者ctDNA检测频率较高。因此ctDNA检测被认为是预后指标，多因素分析显示ctDNA也是预测复发的独立危险因素。研究还评估了17例患者术前和复发时匹配血浆中的突变频率，发现6例患者复发时的细胞游离DNA突变率高于初级诊断时的突变率。因此ctDNA升高可能是监测复发的一个指标，这表明即使诊断时肿瘤是局部的，也可能发生肿瘤扩散[17]。

目前，PARPi用于治疗BRCA1/2突变以及HRD的卵巢癌患者已进入卵巢癌临床标准治疗路径，然而，尽管PARP抑制剂可显著提高晚期卵巢癌患者的生存期，但是部分患者仍不可避免地进展为耐药性患者。越来越多的PARP抑制剂的耐药机制也相继报道。通过ctDNA的动态监测也可探索卵巢癌PARPi的潜在耐药机制。2019年ARIEL2随访研究中通过ctDNA标准对具有BRCA1/2突变的患者在PARP抑制剂治疗前和进展后进行检测，发现18%的铂难治患者和13%的铂耐药患者具有BRCA回复突变，而在铂敏感的患者中仅有1例。经PARP抑制剂治疗后，78例疾病进展患者中有8例患者检出BRCA的回复突变[18]。通过ctDNA检测在乳腺癌和卵巢癌铂类/PARP抑制剂耐药的患者中检出BRCA的回复突变[19]。因此可通过cfDNA测序分析检测卵巢癌PARP抑制剂或铂耐药患者的突变。

3.3 ctDNA在卵巢癌治疗反应中的预测作用 在卵巢癌治疗前，检测ctDNA将有助于早期发现，并根据患者的分期做出适当的治疗。在治疗过程中，定期监测ctDNA可阐明从基因改变获得的耐药性，这是现在常规方法检测不到的。此外，ctDNA还可检测残留病灶，有助于预防肿瘤的复发。因此，基于ctDNA的药物反应预测可打开卵巢癌治疗的新视野[20]。研究表明，ctDNA评估可能对预后和治疗都有意义，在妇科癌症患者中提供个体化的癌症治疗。较高的ctDNA最大突变等位基因频率与较差的总生存率相关，与ctDNA基因组改变相匹配的治疗和与ctDNA基因组改变不匹配的治疗相比发现，相匹配的治疗总生存率更高。组织和ctDNA基因组结果显示出较高的一致性，不受时间和空间因素的影响。需更多的研究来更好地定义ctDNA评估在妇科癌症治疗中的作用[15]。对于晚期癌症患者，液体活检检测可用于治疗选择、监测治疗效果及在耐药性发展时确定最合适的后续治疗。

3.4 ctDNA作为MRD(微小残留病灶)生物标志物的应用 原发肿瘤治疗，可通过检测到的微转移性疾病来提高生存率。相当一部分看似治疗成功的卵巢癌患者，其实存在隐匿性微转移或微小残留病灶，并在初始治疗后持续存在，作为随后远处转移复发的潜在来源。研究显示，ctDNA检测可用于监测MRD，从而帮助评价药物，有效消除或控制初次治疗后存在的隐匿性微转移或微小残留病灶，从而降低复发风险[21]。多项回顾性研究表明，ctDNA可在临床症状或现有辅助检查证据出现之前识别残留疾病患者，用于预测复发，且具有较高的敏感性和特异性[22]。Elena Pereira等研究显示，13.7%的患者中，即使CT扫描阴性，ctDNA也能检测到微小癌灶的存在，平均预测领先时间为7个月，明显高于CT成像。且在最初治疗6个月后，ctDNA检测水平与无进展生存期和总生存期显著改善相关。上述研究均表明了在妇科癌症中应用ctDNA可识别残余肿瘤。将肿瘤组织活检、临床辅助检查与基于ctDNA检测的液体活检结合起来，用于指导临床治疗和改善患者预后。通过高度精确的ctDNA检测和定量方法，对肿瘤组织进行非侵入性的监测，能比现有临床监测更早地检测到残余疾病，且肿瘤的体积、代谢和增殖率均与血浆中ctDNA数量正相关，以及基于肿瘤基因组景观进行实时评估和个性化治疗来改变临床预后[23]。研究发现，体液中ctDNA检测也有作为癌症治疗后检测残余病灶的潜力。最终，将MRD的ctDNA分析应用到临床工作中，指导个体化治疗和改善化疗患者预后[23]。

4 ctDNA检测在卵巢癌中面临的挑战

液体活检ctDNA越来越多地被应用于肿瘤学中，然而，它们的使用仅限于临床研究。因此需在应用于临床之前对液体活检进行更多的临床前研究。目前大量研究显示，大多数液体活检检测缺乏临床有效性的证据，特别是在临床应用方面。现在大多数分析方法集中于血浆这单一分析物上，但通过采用多参数分析方法，结合来自血液样本中存在的多个分析物的数据，可以提高分辨率。此外，还可通过腹水、腹腔冲洗液、初次活检组织中的分析物，共同提高分辨率。未来液体活检的发展预计将覆盖一系列学科，包括基础生物学和生理学、分子生物学和分析技术、统计学等。最重要的是，分析开发人员必须要遵循监管指导来建立分析性能和分析有效性。只有在临床有效性和临床效用被证明之后，液体活检才能充分发挥其潜力，并对卵巢癌患者的临床管理产生预期的影响[24]。

5 结论

目前，找到有效的卵巢癌早期检测工具仍是诊断和治疗卵巢癌疾病中最重要的环节之一。现在ctDNA主要作为辅助检测，并不能取代金标准组织活检。早期诊断卵巢癌以及评价卵巢癌的治疗反应、指导用药，将大大改善患者的预后，提高生存率。ctDNA有望成为癌症筛查、诊断、预后评估、药物反应监测和疾病监测的重要临床工具。但ctDNA早期疾病检测的准确性、高实施成本、克隆造血的混淆有待进一步临床实用研究。