神经肌肉接头动态改变在肌萎缩侧索硬化中的研究价值与进展

王雁 潘华

肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是选择性累及上、下运动神经元的神经退行性疾病。发病机制至今仍在探讨中。近年来越来越多的基础研究表明，神经肌肉接头（neuromuscular junction，NMJ）损伤可见于疾病早期，甚至早于运动神经元的变性丢失。临床上，重复神经刺激是评价NMJ功能的主要电生理手段。对临床拟诊的ALS患者进行重复神经刺激检测，部分可见低频递减现象。针对ALS患者早期存在NMJ受累这一现象，本文从基础研究和临床电生理研究两个角度，对ALS疾病进展中NMJ的动态改变和重复神经刺激在其中的应用价值进行综述，旨在提高读者对ALS早期出现NMJ损伤的认识和对重复神经刺激技术在ALS早期诊断中应用的重视程度，并了解当前以NMJ为治疗靶点的药物研究进展。

1 肌萎缩侧索硬化及发病起源

ALS是一种复杂的神经变性疾病，以选择性累及皮质锥体细胞、锥体束、脑干运动神经元和脊髓前角细胞为特征[1]。针对ALS的发病部位，研究者提出了多种假说，主要有“dying forward”假说和“dying back”假说。其中“dying back”假说认为，ALS发病起源于运动神经末梢或肌纤维，因NMJ结构和功能异常而继发运动轴索变性，进而逆向诱导运动神经元变性、死亡[2]。近年来，越来越多的证据表明NMJ解体是ALS的早期病理损伤之一[3]。对于“dying back”假说，目前的支持点包括：①不论是在ALS患者还是动物模型中，多项研究均表明疾病早期可出现明显的NMJ损伤，且往往早于运动神经元的变性丢失[4-6]；②骨骼肌中局限性表达突变超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1，SOD1）基因足以导致NMJ失稳态，并诱导运动神经元变性死亡[7-8]；③仅对神经元胞体采取保护措施并不能阻止NMJ的解体[9]；④即使运动神经元变性被有效逆转，NMJ处的损伤也会持续进展，导致肌肉无力和萎缩[9]。1例来源于ALS患者的尸检报告也证实NMJ损伤早于运动神经元变性丢失，该患者肌电图检查提示上、下肢肌肉均存在失神经改变，两周后该患者死于意外，对其进行尸检发现，此时脊髓前角细胞及前根尚无明显变性丢失[4]。

虽然ALS中皮层运动神经元受累不可避免，但可达成共识的是，NMJ解体是ALS临床症状出现和疾病进展的关键环节[10]。NMJ或将成为ALS早期发现、早期诊断及早期干预的有效靶点。

2 神经肌肉接头的基础研究

NMJ是一种三方突触结构，由突触前运动神经末梢、突触后肌纤维及突触末梢施万细胞构成，共同参与神经肌肉间的信号传递，维持NMJ的稳定。近年来，随着NMJ研究的不断深入，突触前囊泡数量减少、线粒体结构功能紊乱、突触后终板面积减小或碎片化、突触末梢施万细胞表型改变或数量减少等被认为是NMJ损伤的有效标记[11-14]。

2.1 ALS患者相关研究ALS患者的肌肉活检、电生理评估及尸检报告均证实NMJ损伤在ALS早期进展中扮演了重要角色。1984年BJORNSKOV等[15]发现ALS患者NMJ处存在失神经损伤和终板碎片化。同年TSUJIHATA等[16]发现ALS患者的运动神经末梢及终板面积减小，神经末梢内线粒体数量减少。1998年YOSHIHARA等[17]通过喉肌活检发现ALS患者NMJ处存在多种病理改变，包括失神经、突触后膜折叠度下降、神经不全再生等。近年来，分子生物学研究发现NMJ处存在多种分子水平的改变，如突触前电压门控钙通道亚基表达异常[18]、神经轴突生长抑制因子Nogo-A表达增加[19]、乙酰胆碱受体亚单位表达异常[20]等。

2.2 ALS动物模型研究研究者最常利用SOD1G93A小鼠模型来探索ALS中NMJ的病理改变。在小鼠出生后第7天，可见运动神经末梢形态圆钝，其内线粒体出现空泡化改变，但NMJ结构保持完整[5]。出生后第25天，快收缩肌纤维中可见失神经改变，而慢收缩肌纤维无明显异常，此时尚未出现临床表现。出生后第30天，快收缩肌纤维失神经损伤明显增多，神经末梢内可见线粒体数量减少、形态肿胀及乙酰胆碱囊泡数量减少[5,9]，突触后膜折叠度降低[5]等。随着时间进展，可见脊髓运动神经元中突变SOD1蛋白聚集，胞浆空泡变性，线粒体肿胀等。继之出现运动单位数量减少、运动神经元广泛丢失，临床出现典型的肌肉无力和萎缩。在果蝇肌肉组织中特异性表达二肽重复蛋白，发现多聚甘氨酸-精氨酸蛋白的过表达可诱导NMJ结构异常，并伴谷氨酸能神经元的变性退化[21]。在突变TARDBP基因小鼠模型中，可见斑块样NMJ，提示TDP-43蛋白（TAR DNA binding protein 43,TDP-43）的正常功能对于NMJ形态的成熟和稳定至关重要[22]。在TDP-43Q331K小鼠模型中可见NMJ处乙酰胆碱受体区域面积减少，完整NMJ的数量较健康对照组明显减少[23]。hTDP-43ΔNLS小鼠模型研究发现，在小鼠生后4周左右即可见明显的NMJ失神经损伤而运动神经元数量未见减少。相反，利用多西环素来抑制突变TARDBP基因可促进肌肉神经再支配，早期给予药物干预或许会逆转NMJ损伤[24]。FUSΔNLS∕ΔNLS小鼠模型中可见 NMJ处终板面积和终板数量明显减少，而选择性恢复FUS基因在肌纤维细胞核中的表达，可一定程度增加终板面积[14]。hFUS+∕+小鼠模型研究发现，在小鼠出生后第15天，腓肠肌中已有40%出现失神经改变，而脊髓腰段尚无运动神经元数量减少。超微结构分析提示NMJ处存在突触囊泡丢失，突触前膜结构异常以及突触前线粒体数量减少，而终板相对完好[13]。以上研究表明，不同基因突变介导的ALS中，NMJ均存在不同程度的受累，且往往早于运动神经元的变性丢失。

3 重复神经刺激在ALS中的临床应用价值

重复神经刺激（repetitive nerve stimulation，RNS）是临床评价NMJ功能的主要电生理手段。正常情况下，NMJ的安全系数较大，可确保每一次神经冲动都能激发一次肌肉收缩。而在病理情况下，NMJ传递受损，安全系数减小，在一连串持续刺激下，仅有最初的几次刺激可以超过动作电位阈值，从而表现为RNS时复合肌肉动作电位（compound muscle action potential，CMAP）波幅下降。低频RNS主要用于评价突触后膜的功能，而高频RNS主要用于评价突触前膜的功能。临床实践中，可利用低频或高频RNS评价ALS中NMJ的功能，以发现早期异常，提高ALS早期诊断的敏感性。实际上，当前已有多项研究表明RNS可用于早期发现ALS中NMJ异常。

1959年梅奥医学中心的MULDER等[25]首次报告了一例ALS患者中可见RNS低频递减现象。随后，多项研究相继报道了此类现象，提示ALS中NMJ传递受损并不少见。1981年研究发现，在快速进展的ALS患者中进行RNS，可见小指展肌的CMAP波幅显著下降，而在缓慢进展的ALS患者中，未见明显的CMAP波幅下降，提示ALS患者RNS波幅下降与疾病活动性相关[26]。而JAMES等[27]发现相较于远端的小鱼际肌，近端的斜方肌在显示NMJ损伤方面敏感性更高。随后，有研究进一步指出，对于上肢起病的患者，如果三角肌中未见RNS低频递减，则或许可以排除ALS的诊断[28]。斜方肌中RNS低频递减百分数超过5%，对于ALS诊断的特异性可达到100%。2001年有研究对ALS患者的拇短展肌进行低频RNS检测，发现低频递减的幅度与运动末端CMAP的年下降率呈显著正相关，提示RNS低频递减幅度对于未来CMAP波幅的下降具有预测价值[27]。此外，相较于小指展肌，拇短展肌的RNS波幅下降更明显，而这与ALS患者临床常见的“分裂手”现象相一致[29]。随后，有研究指出，ALS患者中小指展肌的RNS低频递减阳性率显著低于拇短展肌和第一骨间背侧肌的阳性率，提示NMJ传递障碍可能参与了ALS中常见的“分裂手”现象[30-31]。2016年有研究表明，正中神经RNS低频递减或可作为ALS诊断的有效标记物[28]。且通过ROC曲线分析，进一步确定正中神经RNS低频递减百分数的cut-off值约为4.3%，而尺神经的cut-off值约为3.2%，均远远低于当前使用的阳性诊断标准值（10%或15%）。2021年有研究表明，相较于健康对照组，ALS患者的RNS低频递减比例明显增高，且在部分ALS患者中，在肌肉出现失神经电位前即可见到RNS低频递减[32]。首诊发现RNS低频递减百分数高的患者，未来疾病进展可能更快。其研究指出低频RNS中CMAP波幅下降可支持ALS超早期即存在NMJ损伤。

4 以NMJ为靶点的潜在干预措施

多项研究均表明单一的运动神经元保护不足以对抗该病。相反，越来越多的证据支持NMJ解体是ALS临床症状出现和疾病进展的关键环节。随着对ALS中NMJ的研究进一步加深，目前提出了多种潜在的以NMJ为靶点的干预措施。

HUANG等[33]指出，利用抗体来阻断死亡受体6可有效维持NMJ的完整性并提高运动能力。BROS-FACER等[34]表明，每周注射抗Nogo-A抗体，可有效改善SOD1G93A小鼠的肌无力症状，促进肌肉神经再支配。HARRISON等[35]的研究表明，在尚未出现临床症状但已有部分失神经损伤的SOD1G93A小鼠中应用酪氨酸激酶抑制剂马赛替尼，可以减少巨噬细胞在NMJ的浸润，保护突触末梢施万细胞并促进神经再支配。马赛替尼三期临床试验显示，在应用利鲁唑的基础上加用该药，可减缓疾病进展，提高患者的生存质量[36]。此外，生长因子如胰岛素样生长因子1在保护NMJ完整性方面也具有一定的作用[37]。化合物TRVA242可能通过增加突触前运动神经末梢的钙离子流入来促进乙酰胆碱的量子释放，或可有效逆转NMJ的病理损伤，提高NMJ的传递功能[38]。目前以上大部分药物在人类临床试验中尚未取得成功，这可能与患者疾病进展处于不同阶段相关。但未来对于ALS的早诊断及早治疗，尤其是以NMJ为靶点的药物研发将成为ALS治疗的关键与希望。

5 总结

ALS是复杂的神经退行性疾病，多病因多机制参与其中。传统观点认为ALS的发病起源于运动神经元变性，然而近二十年来，越来越多的证据表明，在ALS患者和动物模型中均可观察到NMJ结构和功能的异常及骨骼肌代谢的改变，且往往早于运动神经元的变性丢失，提示NMJ解体和能量代谢异常在ALS的起病及发展中扮演了重要角色。NMJ早期受累在不同类型的ALS中是普遍存在的，但其在疾病的发生发展中究竟扮演了怎样重要的角色，目前还尚无肯定回答。未来需要更多的以NMJ为靶点的研究，这对于ALS的早发现、早诊断及早干预都具有重要意义。