分散固相萃取-气相色谱-三重四极杆串联质谱法同时测定沙拉酱中3种防腐剂

刘志鹏，黄敏兴，林继钦，杨李胜，王小鹏，高裕锋，陈其钊*

（1.广东省科学院生物与医学工程研究所，广东 广州 510316；2.中国轻工业甘蔗制糖工程技术研究中心，广东 广州 510316）

沙拉酱是一种西式调味沙司，在西方人的饮食生活中必不可少，主要应用于沙拉、三明治等菜品中，在我国的消费主要集中在大、中城市，消费群体主要为年轻人，目前还有很大的市场空间[1-2]。传统沙拉酱的主要原料是植物油、鸡蛋、食醋，再加上调味料和香辛料等[3]。由于沙拉酱营养丰富、保质期短，生产厂家为保证其能有较长保质期，会加入防腐剂来抑制其中的微生物生长。其中，苯甲酸、山梨酸和脱氢乙酸是在沙拉酱中使用最广泛的防腐剂，但过量的食用会影响人体对维生素和钙的吸收，加重人体肝脏负担，并引起毒症反应或贫血和免疫功能下降[4-7]。GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》规定了上述3种防腐在沙拉酱中的最大使用量分别为1.0 g/kg、1.0 g/kg、0.5 g/kg[8]。

现阶段针对这3种防腐剂的检测方法有高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography，HPLC）[9-13]、气相色谱法（gas chromatography，GC）[14-17]、气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）法[18-19]、液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[20-24]。目前，检测食品中这3种防腐剂的的国标方法为液相色谱法和气相色谱法[25-26]。液相色谱法和气相色谱法虽然前处理简单，仪器维护成本低，但其灵敏度相对较低，定性能力一般，容易出现假阳性情况。据相关文献报道，这3种防腐剂若要实现同时测定，需要用不同的前处理方法和不同仪器设备，实验操作起来费时费力。气相色谱-三重四极杆串联质谱（gas chromatogratriple quadrupole tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）具有高准确性、高效性、基质干扰小的特点，以及多反应监测模式检测的高灵敏度、高选择性和对色谱峰形改善等优点，目前多用于高通量农药残留的检测[27]。国内外对于使用气相色谱-三重四极杆串联质谱法测定食品中多种防腐剂的研究鲜有报道。

本研究采用分散固相萃取（dispersive solid phase extraction，DSPE）结合气相色谱-三重四极杆串联质谱（GC-MS/MS）法同时测定沙拉酱中的3种防腐剂（山梨酸、脱氢乙酸、苯甲酸），对其前处理条件的提取方式、涡旋时间、萃取溶剂进行优化，以期建立一种前处理简单，灵敏度高，抗干扰能力强，能够快速、准确地同时检测沙拉酱中山梨酸、脱氢乙酸、苯甲酸的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沙拉酱：市售；山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸（纯度均＞99%）：广东省计量科学研究院；乙酸乙酯、正己烷、乙醚、二氯甲烷）、石油醚（均为色谱纯）：上海星可高纯溶剂有限公司；七水合硫酸锌（分析纯）：西陇科学股份有限公司；无水硫酸镁（分析纯）：广州化学试剂厂；C18（分析纯）：博纳艾杰尔科技有限公司。

1.2 仪器与设备

TSQ9000三重四极杆气质联用仪、Sorvall ST4 Plus高性能通用台式离心机：美国赛默飞世尔科技有限公司；ME204E电子天平：德国梅特勒-托利多集团；KQ-500DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；UPC-I-60L型超纯水机：成都超纯科技有限公司；MultiReax多位试管涡旋振荡器：德国Heidolph公司；WS-150D型往复式摇床：德国Wiggens公司；HP-FFAP色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国Agilent Technologies公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

混合标准储备液的制备：分别准确称取0.025 0 g山梨酸、脱氢乙酸和苯甲酸标准物质，用乙酸乙酯溶解并定容至25 mL的容量瓶中，得到质量浓度为1 000 mg/L的混合标准储备液，置于4 ℃条件下储存。

混合标准工作溶液的制备：精密量取混合标准储备液100 μL，用乙酸乙酯定容至100 mL容量瓶中，得到质量浓度为1 mg/L的混合标准工作液。然后用乙酸乙酯进行逐级稀释，制得质量浓度分别为0.001 mg/L、0.005 mg/L、0.010 mg/L、0.050 mg/L、0.100 mg/L、0.500 mg/L的混合标准工作溶液。

1.3.2 样品的前处理

准确称取样品1 g（精确至0.000 1 g）置于50 mL离心管中，加入10 mL水、2.5 mL七水合硫酸锌溶液和4 mL氢氧化钠溶液，以转速2 000 r/min涡旋10 min后加水定容至20 mL，于4 000 r/min离心5 min，准确吸取10 mL上清液于50 mL离心管中，加入0.5 mL盐酸溶液（1∶1）酸化后，加入5 mL乙酸乙酯涡旋2 min后，于4 000 r/min离心5 min，移取2 mL上清液于装有分散固相萃取剂（C18和无水硫酸镁各200 mg）的试管中涡旋1 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，待测。

1.3.3 气相色谱-质谱条件

气相色谱条件：HP-FFAP色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序为初始温度50 ℃，保持1 min，以20 ℃/min上升到230 ℃，保持5 min；载气为高纯氦气（He）（纯度≥99.999%）；碰撞气为氩气（Ar）（纯度≥99.999%）；进样口温度为250 ℃；色谱柱流量为1.2 mL/min；分流比为10∶1；进样量为1 μL。

质谱条件：离子源为电子电离源（electron ionization，EI）；离子源温度为300 ℃；传输线温度为280 ℃；扫描方式为选择反应监测（selected reaction monitoring，SRM）模式。3种防腐剂的保留时间、定性及定量监测离子对和碰撞能量参数见表1。

表1 3种防腐剂的保留时间、定性及定量离子对和碰撞能量Table 1 Retention time,qualitative and quantitative ion pair and collision energy of the 3 preservatives

定性定量分析：采用保留时间结合离子对丰度比进行定性分析。以目标物（3种防腐剂）的质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标绘制防腐剂标准品的标准曲线，得到其线性回归方程进行定量分析。回收率计算公式如下：

1.3.4 数据处理

采用Excel 2019对数据进行处理分析，采用Origin 9.0制图。

2 结果与分析

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 提取方式的选择

常规的提取方式有超声、涡旋和振摇。用不含防腐剂的沙拉酱作为样品，进行加标回收实验，3种提取方式均分别处理10 min，其中超声处理的功率为1 500 W，涡旋振荡器转速设为2 000 r/min，往复式摇床振摇频率为300 r/min，其余条件按照1.3.2前处理，考察3种提取方式（超声、涡旋和振摇）对回收率的影响。提取方式对回收率的影响见图1。由图1可知，整体来看，采用涡旋提取方式，山梨酸、脱氢乙酸及苯甲酸的平均回收率较高，这3种防腐剂的平均回收率分别为89.6%、95.4%、104.2%。超声与振摇的提取方式对提取效果的影响差别不大。因此，选择涡旋提取方式。

图1 提取方式对回收率的影响Fig.1 Effect of extraction method on recovery rates

2.1.2 涡旋时间的选择

采用涡旋提取方式进行提取，考察涡旋时间分别为2 min、5 min、10 min、15 min、20 min、30 min对样品回收率的影响。涡旋时间对回收率的影响见图2。由图2可知，随着涡旋时间在2～10 min内的延长，3种防腐剂的平均回收率呈明显增加趋势；当涡旋时间＞10 min后，平均回收率增加趋势较为平缓。当涡旋时间为10 min时，山梨酸、脱氢乙酸及苯甲酸的提取率分别为91.2%、98.3%、101.0%。因此，选择涡旋时间10 min。

图2 涡旋时间对回收率的影响Fig.2 Effect of vortex time on recovery rate

2.1.3 萃取溶剂的选择

选择正己烷、乙酸乙酯、石油醚、乙醚、二氯甲烷5种溶剂进行实验，在其他条件不变的前提下，考察用不同萃取溶剂对回收率的影响。萃取溶剂对平均回收率的影响见图3。由图3可知，当选择乙酸乙酯作为萃取溶剂时，3种防腐剂的平均回收率较高，提取效果最佳，山梨酸、脱氢乙酸、苯甲酸3种防腐剂的平均回收率分别为89.0%、96.2%、104.5%。因此，选择乙酸乙酯作为萃取溶剂。

图3 萃取溶剂对回收率的影响Fig.3 Effect of extraction agents on recovery rate

2.2 分散固相萃取剂的净化效果

沙拉酱是一种高脂肪食物，每100 g传统沙拉酱脂肪含量在50 g以上[2]。因此，在净化步骤中着重针对脂肪进行除杂，选择C18与无水硫酸镁各200 mg组合成分散固相萃取剂，对萃取溶液进行净化，考察其净化效果。加入分散固相萃取剂前后的样品总离子流色谱图见图4。由图4可知，加入分散固相萃取剂后，样品总离子流色谱图的背景干扰明显要小于未经净化的样品，整体基线也更加平稳。实验过程中也未发现分散固相萃取剂对3种防腐剂的回收率有影响（3种防腐剂回收率均在85%～105%范围内）。为了保护气相系统的洁净度和降低样品背景的干扰，故选择加入分散固相萃取剂作为净化步骤。

图4 加入分散固相萃取剂前（A）、后（B）的样品总离子流色谱图Fig.4 Total ion chromatogram of the samples of before (A) and after (B) adding dispersant

2.3 方法学考察

2.3.1 方法的线性回归方程、检出限与定量限

3种防腐剂的线性回归方程、相关系数、检出限和定量限见表2。由表2可知，3种防腐剂在质量浓度0.001～0.100mg/L范围内呈现良好的线性关系，相关系数R2≥0.999。在称样量为1.00 g时进行低浓度加标回收实验，以目标峰高等于3倍基线噪音为检出限，目标峰等于10倍基线噪音为定量限进行计算，方法的检出限为0.002～0.010 mg/kg；方法的定量限为0.006～0.030 mg/kg。3种防腐剂的检出限与定量限均远低于国标方法，说明本方法具有一定优越性。

表2 3种防腐剂的线性回归方程、相关系数、检出限和定量限Table 2 Linear regression equation,correlation coefficient,detection limit and quantification limit of 3 preservatives

2.3.2 加标回收率和精密度试验

以不含防腐剂的沙拉酱作为空白样品进行加标回收率试验，分别准确加入0.05 mg/kg、0.10 mg/kg、0.50 mg/kg 3个水平浓度的3种防腐剂混合标准溶液，按照方法1.3.2进行前处理，每个添加水平做6次重复试验，计算其加标回收率、精密度试验结果相对标准偏差（relative standard de viation，RSD），结果见表3。由表3可知，空白沙拉酱中3种防腐剂不同加标水平下的平均回收率和RSD范围分别为88.6%～104.8%、2.0%～5.3%，符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》要求。结果表明，本方法具有良好的准确度和精密度，能满足日常检测的要求。

表3 3种防腐剂的加标回收率及精密度试验结果Table 3 Results of spiked recovery and precision tests of 3 preservatives

2.4 实际样品检测中该方法与国标方法的比较

将该方法运用到从市场随机购买回来的38份样品中进行检测。结合GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》判定，样品的实际检出情况为：山梨酸检出率为63.1%；脱氢乙酸的检出率为8.8%；苯甲酸检出率为21.1%，没有不合格样品。选取3种防腐剂均为阳性的一份样品，采用本方法与国标方法进行比较，试验结果见表4。由表4可知，采用本方法检测的山梨酸、脱氢乙酸、苯甲酸的实测值分别为0.135 g/kg、0.127 g/kg、0.158 g/kg，采用国标方法检测的这3种防腐剂的实测值分别为0.129 g/kg、0.122 g/kg、0.147 g/kg，说明本方法与国标方法的试验结果无明显差异，采用本方法检测的这3种防腐剂的RSD分别为3.4%、2.9%、3.7%，国标方法检测的这3种防腐剂的RSD分别为4.1%、2.8%、4.5%，该方法的RSD在一定程度上优于国标方法。该方法的检测效率具有一定优势，仅需要一次简单的前处理，一台仪器，便能同时准确地对3种防腐剂进行定量。

表4 本方法与国标方法检测结果的比较（n=6）Table 4 Comparison of determination results of the method with national standard method (n=6)

3 结论

本研究采用分散固相萃取结合气相色谱-三重四极杆质谱法对沙拉酱中的山梨酸、脱氢乙酸和苯甲酸进行测定。针对沙拉酱是一种高脂肪食物，最佳前处理条件为加入10 mL水、2.5 mL硫酸锌溶液和4 mL氢氧化钠溶液涡旋处理10 min后加水定容至20 mL，于4 000 r/min离心5 min，准确吸取10 mL上清液于50 mL离心管中，加入0.5 mL盐酸溶液（1∶1）酸化，加入乙酸乙酯涡旋2 min后4 000 r/min离心5 min，移取2 mL上清液于装有分散固相萃取剂（C18和无水硫酸镁各200 mg）的试管中涡旋1 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，待测。在此优化前处理条件下，3种防腐剂在质量浓度0.001～0.100 mg/L线性范围内呈良好的线性关系，相关系数R2均＞0.999，平均加标回收率为88.6%～104.8%，精密度试验结果的相对标准偏差（RSD）为2.0%～5.3%，方法检出限为0.002～0.010 mg/kg，定量限为0.006～0.030 mg/kg。该方法对比国标方法，灵敏度更高、定性准确、所需仪器更单一、抗干扰能力更强，可以满足沙拉酱中多种防腐剂的检测需求。