禽白血病检测技术研究进展

张振兴，薛晓岩，2，胡 骑，季 佳，2，王 斌，宋建领

（1.云南省畜牧兽医科学院，云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明 650224；2.西南林业大学生命科学学院，云南昆明 650224；3.威信县动物疫病预防控制中心，云南威信 657900）

禽白血病（avian leukosis，AL）是由禽白血病病毒（avian leucosis virus，ALV）引起的一种呈世界性分布的禽类重要免疫抑制性疾病[1-2]。ALV属于逆转录病毒科α 反转录病毒属，是一种有囊膜的单股正链线性RNA 病毒[3-4]。ALV 可造成感染鸡群对免疫应答产生抑制而降低抗感染的能力，产生肿瘤、生产性能下降甚至死亡等多种危害[5-6]；人工感染情况下，对鸽、鹌鹑、鹧鸪等也可引起肿瘤病变，严重者可导致死亡[7]。

我国在1999 年从国外引进的白羽肉鸡中首次发现ALV，随后在蛋鸡、地方品种鸡以及野鸟中也发现了病毒感染[8-9]。ALV 感染鸡引起的死亡率可达20%以上，给我国养鸡行业造成了严重经济损失。国内的ALV 净化工作起步较晚，至2013 年基本控制了AL 疫情发生，但2015 年后ALV 又在我国地方品种鸡中流行[8]。

AL 严重威胁我国家禽种质资源安全，2021 年被我国列为《国家动物疫病监测与流行病学调查计划（2021—2025 年）》中需要防范的主要禽病之一。针对AL 防控，至今仍未发现任何有效药物和疫苗，目前最主要的手段是通过不断净化，切断外源性感染途径，以控制ALV 传播。虽然可以通过临床解剖、病鸡病理学观察及流行病学调查等对AL 进行初步诊断，但因其临床症状与马立克病病毒（Marek's disease virus，MDV）、禽网状内皮组织增生病病毒（reticuloendotheliosis virus，REV）等引起的疫病症状有相似之处[10]，容易被误判，延误疫情防控，所以实验室检测是必不可少的环节，而准确高效的检测技术对开展AL 流行病学调查和净化具有重要意义[11]。目前，世界各国已经建立了多种ALV 检测和净化方法，包括病原学检测、病理学检测、血清学检测、分子生物学检测等。

1 病原学检测

病原学检测主要是病毒分离鉴定。将感染动物的粪便、精液、血液、组织（脾脏、肾脏、淋巴结、肝脏等）处理后接种ALV 敏感细胞来分离病毒。最常用的分离培养细胞是DF-1 细胞或CEF 细胞，一般在细胞中培养5～7 d，连续培养3 代后分离病毒。病毒分离后用反转录PCR（RT-PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、中和试验（NT）等方法，对分离毒株进行鉴定和亚群区分。病毒分离鉴定是诊断AL 的金标准，但其对实验室条件要求高，培养时间长，经济成本高，培养过程容易受外界污染，因而难以在基层推广应用。为了提高ALV 分离效果，科研工作者做了许多优化和改善。例如：对含有ALV 的鸡血浆分离血清时，用抗凝血静置法替代传统离心法[2]；加入鸡血浆改进培养液替代常规培养，以便更有利于DF-1 细胞的维持和生长[2]；对CEF 细胞培养进行重新定义，解决无法排除内源性ALV 干扰问题[10]；将维持液成分中的胎牛血清替换为驴血清，以有利于ALV 培养[12]。

2 病理学检测

2.1 病理组织切片

运用病理组织切片技术进行鸡群ALV 感染筛查。通常选取鸡群中已经产生明显肿瘤病变的组织，进行常规制片和苏木精-伊红染色，通过显微镜观察病变组织的病理形态。该方法只能确定组织是否产生了肿瘤病变，但很难确定是否由ALV 引起。也有学者发现，如果病变组织切片胞浆中含有大量圆球形嗜酸性颗粒的骨髓细胞瘤性病变，那么就可以基本断定该鸡群感染了J 亚群ALV[13-14]，或许这对其他亚群ALV 的鉴定带来一定的参考价值。病理组织切片观察需要具备一定的经验，初学者容易做出误判。随着分子生物学技术的飞速发展，病理组织切片技术的使用越来越少。

2.2 免疫组化技术

免疫组化技术是通过标记ALV 特有抗原或与ALV 相结合的特异性抗体，对组织内分布的抗体或抗原进行原位检测的技术。张玲娟等[15]曾将组织芯片技术和免疫组化染色技术相结合，选取J 亚群ALV 囊膜蛋白gp85 的单克隆抗体检测发病鸡肝脏、脾脏、肾脏等组织切片的ALV 阳性抗原。虽然该种方法检测ALV 的准确率较高，但是近几年很少有通过免疫组化技术进行ALV 检测的研究。这可能是因为抗原表位识别需要特异性抗体，而针对不同亚群ALV 就需要设计合成不同的特异性抗体，成本较高，操作繁琐。虽然无法改进特异性抗体制备工艺，但是可以进一步优化免疫组化检测技术中的抗原修复时间、单抗稀释比例、DAB 染色时间等多个步骤[16-17]，使其更有利于AL 的鉴别诊断。该方法虽然能够对抗原进行定位，但操作过程比较复杂，且影响试验结果因素较多，因此主要应用于实验室研究，而基层推广应用较少。

2.3 间接免疫荧光检测（IFA）

IFA 是利用抗原与抗体反应的原理，对抗原或抗体进行荧光色素标记，通过观察抗原和抗体结合后是否产生荧光反应来进行病毒筛查。该检测技术建立时间较早，1998 年Smith 等[18]就提出了检测ALV 特异性抗原的荧光抗体检测方法，但其局限性也很多。例如：运用此种方法进行ALV 检测必须具备荧光显微镜、ALV 各亚群特异性单克隆抗体等；可能会出现非特异性荧光，对ALV 的检测筛查产生主观误导。秦爱建等[19]对J 亚群的ALV变异株进行IFA 检测时就产生了很多非特异性荧光；以DF-1 细胞培养的ALV 作为抗原，通过IFA进行鸡血清抗体检测，发现操作较为复杂[20]。以上局限性制约了该方法的推广应用。

3 血清学检测

3.1 中和试验

传统NT 技术是一种可以检验ALV 抗体或抗原且敏感度较高的技术。秦爱建等[21]用自研单抗做NT检测，再用ELISA对ALV复制情况进行检测，发现两种技术的检测结果基本相符，证明制备的特异性单抗可以中和ALV。传统NT 技术敏感度较高，可以进行大批量疑似ALV 感染鸡群检测，但由于其对实验室条件要求较高、操作繁琐、所需时间较长等原因，在实际生产过程中很少用于AL 筛查和诊断。为克服传统NT 技术的缺点，很多科研学者不断运用新技术，尝试对NT 技术进行优化和改进：以假病毒为基础的NT 技术，不仅可以检测抗体滴度，还可以进行高通量测定[22]；创建mRNA 转录抑制法，解决空斑减少中和试验的检测周期长、敏感性低等问题，使其更加灵敏、快速、精确[23]；以改造工程细胞为基础的中和抗体检测方法，可以大大减少多种病毒的前期改造工作，使其能够快速应用于新发传染病研究[23]。NT 技术虽然仍有不足，但是随着新技术的不断研发，其在ALV 检测中重要性也会重新体现。

3.2 ELISA

ELISA 方法可用于血清、细胞培养液、胎粪等材料的ALV 检测。国内外针对ALV 设计的ELISA 检测试剂盒主要检测ALV 的p27 抗原，其优势在于省时省力、样品所需用量少，可以对大批量样品进行检测，不需要大量的仪器设备，现已成为国内外众多种鸡培育公司、养鸡场的主要ALV检测方法。但是p27 抗原高度保守，无法区分外源性和内源性ALV[24]，还需要对ALV 阳性样品env基因（或gp85基因）进行测序才能划分ALV 亚群。另外，ELISA 试剂盒以其设定的S/P值为判定标准，对检测结果可能会出现“假阳性”或“假阴性”的误判；即使达到阳性S/P值判定标准，也只能证明样品曾经感染过ALV，因而会造成一定数量的“误杀”损失。因此，提高操作人员ELISA 检测熟练度[25]，有针对性的选择灵敏度高、稳定性强的ELISA 检测试剂盒，对于减少误差，加快场内ALV 净化起着至关重要的作用[20]。

3.3 胶体金免疫层析

胶体金免疫层析技术是以胶体金作为示踪标志物，通过标记与ALV 相应的特异性抗原或抗体，使待检样品中相应的抗体或抗原在载体的T 线或C线发生特异性免疫显色反应的一种检测方法[26]，其优势在于操作简单、实用性强。胡卫国[27]利用ALV-A 单抗作为示踪标志物，以ALV-A 多抗作为T 线抗体，成功建立了一种ALV-A 胶体金免疫层析检测方法，相比于PCR 检测技术，其假阳性率更低；赵巍[28]研制了一种ALV-J 血清抗体胶体金试纸条，发现其检测效果与ELISA 相符，并且能检测到更低浓度的高免血清。由此可见，虽然胶体金免疫层析技术在我国兽医领域起步较晚，但由于其显著的优点，将会在动物疫病防控领域发挥更大的优势和作用[29-30]。

4 分子生物学检测

4.1 RT-PCR

RT-PCR 检测技术通过提取样品特异性核酸，结合微量RNA 进行ALV 检测。宋建领等[31]针对ALVgp85基因设计合成1 对引物，对感染ALV 病鸡的组织样品提取核酸进行RT-PCR 检测，结果发现该方法敏感性高，目的条带清晰，无杂带。但是RT-PCR 方法对样品病毒含量无法定量，而且容易出现假阳性或假阴性，PCR 扩增产物需要电泳观察等，已逐渐被荧光定量PCR 技术代替。

4.2 荧光定量PCR

荧光定量PCR 检测方法以设计指定的ALV 荧光探针和特定引物为核心，对ALV 进行快速检测和定量，是一种检测灵敏度高、易于操作、自动化程度高的省时省力的检测方法。严立福等[32]以ALV 分离株（FGD1803）基因组为模板，构建重组质粒建立了SYBR Green I 荧光定量PCR 方法；SYBR Green I 染料可以与任何dsDNA 结合，无需设计和优化探针，有效提高了定量PCR 的检测效率，同时该染料稳定性高，不容易失活；王萌[33]以ALV 阳性病料gag基因相对保守区域作为检测目的片段，建立了SYBR Green I 荧光定量PCR 方法，使得结果更可靠准确。这些均说明ALV 荧光定量PCR 检测方法特异性强、重复性好[34]，因此被广泛应用。

4.3 数字PCR（ddPCR）

ddPCR 作为一种新型生物检测技术已经逐步应用于病原微生物检测、病原体定性等多个领域当中，其原理是对样品进行PCR 扩增前先进行微滴化处理，通过对PCR 扩增后产物进行微滴判读，来确定检测样品为阳性或阴性。其优点在于不需要依赖Ct 值和标准曲线就能实现绝对核酸定量，对核酸浓度要求低，对特殊样品有一定的高耐受性，检测费用低廉[35-36]。但是ddPCR 检测仪器较为精密，对检测人员操作要求高，基因倒位或大片段缺失会影响检测准确性，因而限制了其适用范围[37-38]。

4.4 环介导等温扩增（LAMP）

LAMP 检测技术从问世到现在已有20 多年，无论是检测原理、所需引物设计还是反应产物判定均已逐渐成熟化、标准化，成为基层检测人员使用的主要检测手段之一。相比于RT-PCR 检测技术，LAMP 检测技术不需要对各阶段反应温度进行繁琐设定，全过程在同一温度设定条件下即可完成。不仅如此，这项检测技术还大大降低了对各种设备仪器的要求，反应时间也比RT-PCR 缩短了一半以上。近几年，Peng 等[39]根据ALV 中的pol基因，设计合成4 对特异性引物，建立了可检测A、B、E、J 等亚群ALV 的LAMP 检测方法；张民秀等[40]设计的ALV LAMP 检测方法不仅能对ALV 感染进行快速诊断，还可以对ALV、鸡传染性贫血病毒（CIAV）的混合感染提供技术支持。

4.5 高敏荧光微球检测

高敏荧光微球检测方法是根据时间分辨荧光免疫层析原理设计的一种应用于ALV 检测的新型检测方法，其通过仪器读取反应后免疫复合物中的荧光微球发光值，测算ALV p27 抗原数值，从而进一步判定是否感染ALV[41-42]。此种方法操作简便，可适用于大批量样品的快速定量检测，与胶体金试纸条检测方法一样，可作为基层使用的快速诊断检测技术[43-44]。

5 结语

不同的ALV 检测技术各有其优点和不足。随着新技术的发展和完善，各种应用于ALV 检测的技术得到了不断优化、改进和发展。充分了解现在已有的ALV 检测方法，并在日常检测中根据各检测方法的优缺点和自身实际情况进行综合考量、选择，或对不同检测技术进行优化组合，可以提高ALV 检出率，缩短净化时间，提高工作效率。