牛副结核病防控

王淑娟，杨为强，宋 梅，于小静，吕 艳，孙成友，王 华，吴晓东

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.青岛市即墨区农业农村局，山东青岛 266200）

牛副结核病（bovine paratubereulosis） 也称牛副结核性肠炎，由Johne 和Frothingham 于1895 年首次发现，所以又叫约翰氏病（Johne's disease），是一种反刍动物的慢性消化道疾病，由副结核分枝杆菌（Mycobacterium aviumsubsp.paratuberculosis，MAP）引起，是以持续性顽固性腹泻、渐进性消瘦为特征的慢性肠道肉芽肿性人兽共患传染病[1]，常见于牛，特别是奶牛，给畜牧业造成了巨大危害。世界动物卫生组织（WOAH）将副结核病列为须通报动物疫病，我国将其列入三类动物疫病。

1 病原学

1.1 病原分类

牛副结核病的病原为副结核分枝杆菌，属于分枝杆菌属，与结核分枝杆菌相似。

1.2 病原特点

革兰氏阳性杆菌，专性细胞内寄生，不能在环境中繁殖，但能在水中的变形虫体内复制[2]；具有抗酸染色的特性；病原抵抗力强，耐寒、耐高温、耐干燥、耐紫外线、耐酸性环境，在被污染的土壤及水源中能存活1 年以上[3]，为需氧菌；最适生长温度37.5℃，最适pH6.8～7.2[4-5]。MAP 为短杆菌，长0.5～1.5 μm，宽0.3～0.5 μm，不形成芽孢和荚膜，无鞭毛，有的呈球杆状，有的呈短棒状[4]；病原体在组织和粪便中排列成团状或丛状，形态不典型，在感染的动物体内，主要存在于病灶部位。

1.3 培养特性

病原进行细菌培养生长缓慢，分离极为困难，需要特殊培养基进行培养，比如添加分枝杆菌素的Herrold 氏卵黄培养基，一般接种5～8 周后，最长达6 个月后才能观察到肉眼可见小菌落，最初透明小菌落呈半球状，随着培养时间的延长，菌落外观似乳头状。

2 流行病学

2.1 传染源

病畜和潜伏感染的带菌畜是主要传染源，其分泌的乳汁和排出的粪便、尿液等都可能污染环境、水源、生产用具而传播该病。人类副结核病的主要传染源是患畜的乳、肉制品及内脏器官等，其次是被污染的环境、水源等，未见人与人直接传播的报道[6]。

2.2 传播途径

牛副结核既可水平传播也能垂直传播。主要传播途径是动物采食了被污染的饲料、牧草或饮水经消化道传播，也可通过精液或胎盘垂直传播。犊牛可经母体胎盘或乳汁感染该病病原[7-8]。在感染牛群牛舍的尘埃中也能检测到病原菌，研究证明气溶胶也是重要的水平传播方式之一。引进感染牛是传播该病的主要方式，处于发病阶段的病牛排菌量是潜伏期的100 倍以上，1 头临床病牛排出的病原菌能感染超过25 头健康牛[9]。

2.3 易感动物

主要易感动物为反刍动物，包括牛、羊、骆驼、羊驼、鹿等，另外马、猪、猴、兔、狐狸、黄鼠狼等也可被感染。MAP 易感性与年龄有关，年龄越小越易感，6 月龄以下幼畜最易感，尤其是出生后24 h 之内的犊牛。牛特别是奶牛最易感，母牛在怀孕、分娩及泌乳期一旦机体抵抗力变差就更容易被感染。另外饲养管理不善、饲料营养不均衡、饲料缺乏矿物质、饲养密度过大等原因都可使牛免疫力降低从而易感。易感性还和牛的品种有关，娟姗牛比荷斯坦牛更易感[9]。

2.4 潜伏期

动物感染该病后潜伏期一般都很长，最长可达15 年，大部分约有2～5 年的隐蔽期和亚临床期，所以发病牛基本在2～6 岁出现临床症状，但4～15月龄的牛也可能发病，这与应激、营养不良、抵抗力差、感染其他病原等有关。

2.5 流行特征

该病无明显的季节性，但常发生于春秋两季。该病特点是发展缓慢、病程长、感染率高，大多呈地方性流行或散发，集中养殖状态下发病率较高，多数集中发病于规模养殖场，分散饲养发病率较低。此外，母牛妊娠、生产及泌乳期间或者气候恶劣、剧烈变化时发病率高。

2.6 流行概况

牛副结核病呈全球性分布，遍布世界各地，在世界各国均有流行，给养牛业造成了严重经济损失，尤其是美国、英国、德国、加拿大、澳大利亚等养牛业发达国家深受其害[10-11]。2013 年美国奶牛个体阳性率为5%～10%，牛群阳性率达91.1%。我国最早是1955 年在内蒙古一牧场发现该病，此后该病又在黑龙江、辽宁、河北、贵州、山西、陕西、新疆等很多地区发生。吴建勇[12]等在2014—2015年对新疆某牛场连续4 次开展血清学检测，发现副结核病阳性率分别为13.51%、2.91%、7.55%、33.33%，4～5 岁牛群检出率最高，检测间隔时间越长对防控该病越不利。孙雨等[13]2014—2015 年对我国山西、西藏、新疆、河北、青海、重庆、湖北等地区开展了牛副结核病的血清学调查，发现阳性率分别是3.75%、3.5%、2.2%、2.0%、1.5%、0.75%、0.5%。近年来由于奶牛和肉牛业发展非常迅速，集约化、规模化养殖越来越多，牛副结核病也呈上升趋势：北京奶牛场该病的发病率普遍在10%～12%[14]；胡晓艳等[15]2017—2019 年对上海市松江区的规模牛场随机采样进行牛副结核病抗体检测，发现3 年的抗体阳性率分别为1.6%、0.7%、4.4%；赵怡雯[16]等在2018—2020 年对大连市的规模化奶牛场进行了血清学检测，发现3 年的抗体阳性率分别为8.04%、2.07%、8.31%。

3 危害

该病潜伏期长，患畜长期大量排菌，传染性强，无有效治疗方法，一旦发病很难净化根除，给牛场造成的经济损失非常严重，对畜牧业危害非常大。主要危害有患病牛消瘦、生产性能下降、饲料转化率降低、产奶量下降、受胎间隔时间延长、引发乳房炎和繁殖障碍、易感染其他病原甚至死亡[17-18]等。该病可造成奶牛产奶量下降5.9%～20.0%，牛群死亡率增加6.0%。据估计，每年美国奶业因副结核病造成的经济损失为2 亿～15 亿美元，每年每头牛遭受的经济损失为75～100 美元[10]，仅由于产奶量下降每年就有2 亿美元的损失[14]。英格兰每年因副结核病造成的损失达15.4 亿美元[10]。我国1头患有副结核的奶牛被淘汰造成的经济损失达1 万元以上[14]。此外，人类食用被MAP 污染的牛肉、牛奶或奶制品，接触或食用污染的内脏器官等感染MAP 造成溃疡性肠炎、过敏性肠道症状[9]，被称为克罗恩病（Crohn's disease）。传统的巴氏消毒法不能将奶制品中的MAP 完全杀死，所以该病不但严重危害畜牧业，也对人类有潜在威胁。该病在养牛业发达国家广泛流行，目前尚未有国家能彻底消灭该病，美国酪农杂志曾将该病称为养牛业的“癌症”[17]。

4 诊断

早发现早诊断对于疫病防控非常重要。该病在发病初期症状与腹泻类疾病相似，容易与牛病毒性腹泻、寄生虫性胃肠炎、冬痢等疫病混淆，所以可结合临床表现和病理变化进行初步诊断，再通过实验室方法进行确诊[18]。

4.1 临床表现

该病潜伏期长，病牛发病初期无明显临床症状，发病后临床上主要表现为腹泻、营养不良、贫血、消瘦、体重下降、生产力下降、嗜睡甚至死亡等。发病早期会出现间歇性腹泻，然后慢慢发展成顽固性腹泻，粪便常呈喷射状排出，稀薄带有气泡和大量黏液并伴有恶臭，有时会有血块。随着病期延长，病牛反刍功能下降，精神不振、食欲减退、逐渐消瘦、眼窝凹陷、生产性能严重下降、泌乳减少甚至停止、虚弱无力、卧地不起等[19]。

4.2 病理变化

病理学特征为慢性增生性肠炎，肠系膜淋巴结炎及淋巴管肉芽肿。主要病理变化在消化道和肠系膜淋巴结。消化道的损害主要集中于空肠、回肠和结肠前段，特别是回肠肠壁增厚，肠黏膜脱落，表面不平整，质地变硬。肠内容物稀少，含有大量液体和少量气泡，有恶臭。浆膜下淋巴管和肠系膜淋巴结异常肿大，呈索状，暗褐色，切面外翻，多汁。肠黏膜异常增厚达3～20 倍，并形成明显的硬而弯曲的皱褶，黏膜呈黄色或灰色，皱褶凸起充血而色红，有稠而浑浊的黏液[14]。但无明显临床症状的牛扑杀后剖检未见上述病变特征。

4.3 实验室诊断方法

4.3.1 镜检法 病原学检测最常用方法是直肠黏膜粪便检菌法[20]——将直肠刮取物或粪便黏液制成涂片，经抗酸染色后镜检确诊，可观察到红色短小杆菌单个或分枝状排列。该方法操作简单，但由于副结核分枝杆菌的排出是周期性的，不一定得到阳性结果，需要间隔进行多次检测，另粪便样品中还可能存在其他的抗酸菌，容易出现假阳性。

4.3.2 细菌分离培养法 将病料用4% H2SO4或2% NaOH 处理后中和，接种于选择性固体培养基，如添加分枝杆菌素的Herrold 氏卵黄培养基、Dubos 培养基、小川氏培养基或Waston-Reild 培养基等[21]，培养大约5～8 周，有的长达6 个月后才会长出小菌落。细菌培养是唯一不会产生假阳性的方法，是诊断该病的“金标准”，但该方法操作要求高，培养成本高，耗费时间长，很难应用于生产实践[5]。

4.3.3 PCR 法 常用的PCR 方法有常规PCR 和荧光定量PCR。常规PCR 一般根据MAP 基因组中 的F57、IS900、Ismap02、IS1311、Locus255等基因序列设计引物建立传统PCR、巢式PCR 或多重PCR。荧光定量PCR 根据MAP 基因组中的F57、IS900等基因序列设计引物探针来建立[20-21]。PCR 方法有操作简便、快速、成本低，敏感性和特异性都比较高等优点，但也可能存在假阴性和假阳性。

4.3.4 变态反应法 用提纯的副结核菌素和禽型结核菌素进行皮内注射，具体操作方法和判定同结核菌素皮内接种试验相同。为了更好地确诊，可以在颈部两侧分别做结核和副结核变态反应，皮差较大侧则为阳性；也可以静脉注射，体温升高1 ℃为判定标准。此方法可检出感染初期大部分的亚临床症状或无症状病畜，但有明显临床症状的病畜不适合用此法，许多牛在感染中后期会出现耐受性或皮试无反应[20]。

4.3.5 血清学方法 血清学方法有琼扩试验（AGID）、补体结合试验（CFT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等。AGID 特异性不高，存在一定比例假阳性；CFT 操作复杂，也存在假阳性，不适合大规模检测。现在应用最多的是ELISA。该方法快速、灵敏、准确、操作简单，适合大规模检疫，是目前用于检测MAP 血清抗体最敏感而特异的方法，在出入境检疫及牛场净化中发挥着重要作用[22]。研究发现，混合抗原建立的ELISA 方法敏感性和特异性均高于单一抗原建立的ELISA方法。Speer 等[23]2006 年用甲醛和超声裂解处理MAP，提取表面抗原建立ELISA 方法，发现其敏感性和特异性都高达95%以上，高于商业提供的ELISA方法。

4.3.6 全血γ-干扰素ELISA 牛感染MAP 后可对其进行体外模拟变态反应。致敏的淋巴细胞会释放γ-干扰素，而γ-干扰素可用ELISA 方法检测。该方法敏感性为50%左右，特异性在95%以上[23]。

4.3.7 小结 副结核病的诊断方法有很多种，但是每一种都有优缺点，在实际应用中应多种方法联合应用，尽可能提高检测的敏感性和特异性，这对牛场的净化和出入境检疫都有重要意义。牛感染MAP后，机体首先产生细胞免疫，然后是体液免疫。变态反应法检测的是细胞免疫反应，即感染初期还未表现临床症状的牛，ELISA 方法检测的是体液免疫反应，即感染中后期表现临床症状的牛，在牛场中用变态反应和ELISA 同时检测，二者互相补充，可作为确诊和净化该病的有效手段[20]。

5 防控措施

养牛业是畜牧业的重要组成部分，我国对布鲁氏菌病、结核病等动物疫病的防控比较重视，制定了专门的防控规划，但副结核病由于感染初期无临床症状，一般2～5 岁才表现临床症状，所以在牛场的疫病防控中很容易被忽视。随着我国经济的发展，越来越多的牛场发病，严重危害畜牧业的健康发展，同时该病的防控一直是世界性难题，如何进行有效防控一直是生产者和研究人员探讨的问题。考虑到存在潜在的人畜共患风险，探讨该病的有效防控措施对于养殖业的健康发展和人畜的健康安全具有重要意义。该病的防控措施主要从以下几方面入手。

5.1 免疫

疫苗免疫能够在一定程度上降低牛场副结核病的发病率，在成本上比检测并淘汰阳性牛更低。欧美副结核病严重的国家经过长期试验，认为对新生犊牛进行免疫注射，配合必要的兽医卫生防控措施是防控该病最有效的办法，如果严格按照这一防控措施执行，一般5～10 年可以消除该病[24]。目前常用的商品化疫苗有弱毒活疫苗和灭活苗两种。英国及一些东欧国家一般用弱毒活疫苗，美国、挪威等国家用灭活苗[25]。但瑞典政府禁止奶牛用副结核疫苗，美国副结核疫苗的使用也有限制条件[9]。由于牛接种疫苗后在注射部位会产生肉芽肿，会干扰牛结核病的诊断，所以一般不建议使用疫苗，如果要在副结核感染牛群使用疫苗，在新生犊牛一出生就进行隔离并喂消毒乳，7 日龄内进行疫苗接种，同时隔离犊牛并由专人饲养，舍内清扫消毒，用过疫苗的牛禁止出售。目前我国尚未有商品化疫苗。

5.2 犊牛繁育

副结核病主要发生在新生犊牛阶段，年龄越小越易感，主要通过粪-口途径传播，所以加强围产牛和犊牛的管理，减少犊牛接触病原是预防该病的关键。

待产母牛经过检测，阳性母牛和阴性母牛要分开产犊，每头母牛要有单独的产栏并保持干净。繁育犊牛时，要减少粪便污染犊牛。若母牛经检测呈阳性，产犊后应立即将犊牛与母牛分开，给犊牛人工喂养经过灭菌的初乳或阴性牛的牛乳[26]。我国目前奶牛场普遍采取措施如下：对副结核感染牛群中的新生犊牛，出生后立即与母牛分开，给犊牛饲喂经80 ℃加热灭菌20 min 的消毒乳，由专人饲养，勤清扫卫生，经常用来苏儿等消毒。犊牛隔离后分别在1、3、6 月龄进行检测，如果一直为阴性则1 岁以后同健康牛一起混群饲养，如果为阳性，则直接淘汰[27]。

5.3 加强饲养管理

牛场饲养管理水平的好坏直接关乎牛群的生长状况、抵抗力高低和牛场的经济效益，因此养殖场平时应加强饲养管理。

（1）应尽量采取“全进全出”的饲养原则，不同日龄的牛不进行混养。注意牛的保暖和防寒，增强牛体质和抗病力。

（2）饲料营养一定要均衡，要注意饲料的配比，满足不同时期生长的需要，特别是犊牛、怀孕母牛、高产奶牛，不要突然改变饲料，对犊牛要给予充足的营养，提高其免疫抗病能力。不饲喂发霉、污染的饲料，避免饮用被污染的饮水，可以在饲料中添加磷等矿物质，缓解腹泻症状[28]。

（3）创建良好的活动场所，让牛到运动场上自由活动。运动可以增加牛的抵抗力，强健犊牛骨骼。运动场要定期清理粪尿，保持干净。犊牛出生1 周以后，最好每日有 l h 的户外运动时间，夏季避开中午以防犊牛中暑。阴冷等恶劣天气不要运动。

（4）饲养员平时要做好牛群的日常巡查，经常巡视观察牛群身体和精神健康状况，对牛的饮食、排泄等情况要有所了解，发现异常要及时处理。大群饲养时，对有问题的牛，如食欲不振、精神状态差、消瘦、腹泻等牛要做好标记，进行重点饲养管理，必要时做好诊断排除工作。

5.4 加强引种检疫

引种不慎往往是发病的主要原因，所以要认真对待引种工作，不从疫源地引种，加强引种检疫，这是预防该病的有效措施。

禁止从疫区引进牛种，从场外引进牛时，要做好调查，保证引进的牛来自清洁的牛场。引种应进行严格的检疫、隔离，禁止受感染牛进场，隔离一个月后无异常再混群饲养。

5.5 加强生物安全防控

平时加强生物安全，做好牛场环境的卫生消毒工作，做好感染牛及被污染环境的处理工作，能有效防止该病的传播。

（1）牛场要执行严格的消毒制度，定期进行全场消毒，在牛场入口和牛舍的入口设消毒池，对进出车辆和人员严格消毒。对环境、用具等要用消毒药科学有效消毒。

（2）饲养员禁止在舍内饮水、吃东西，注意个人卫生，与牛接触后要洗手，不吃未消毒的原料奶和未煮熟的肉类和内脏，不得随意串舍，不得交叉使用舍内用具及设备等。

（3）对腹泻且久治不愈的病牛必须认真检查，需要进行剖检时应在专门的实验室进行，必要时采取细菌学检查或变态反应等诊断方法判断病牛是否患有副结核病；若确定患病，应及时淘汰所有阳性牛。病、死牛不得出售，应按照国家有关规定处理，严禁抛于道路两旁壕沟地沟、池塘。及时清理牛舍内的粪便，运动场的积粪也应定期清理，尤其在雨季。

（4）被病牛污染过的牛舍、栏杆、饲槽、用具、绳索和运动场等，要用生石灰、来苏儿、苛性钠、漂白粉、石炭酸等消毒液进行喷雾、浸泡或冲洗。牛舍在消毒后1 年内不能再饲养动物。粪便应堆积高温发酵后作肥料用。

（5）牛场要设立隔离区，减少牛群间的接触。若发现疑似病牛，立即将其隔离饲养观察，加强监控，不与健康牛混群饲养。疑似牛须定期检测，连续三次以上阴性可判定为假定健康牛，如果检测为阳性或仍然可疑则按照阳性牛处理。

（6）对曾检出过病牛的牛群，要在8 月龄后进行全面、定期检测，每年至少检测3～4 次，通过淘汰阳性牛等全场净化措施防控该病扩散流行，逐步净化牛群[29]。

5.6 加强宣传培训指导

加强培训宣传指导工作，让养殖户充分了解该病的流行特点、传播途径，加强防护，做好防范工作，一旦牛场发病可以做到早发现、早诊断、早处理。

5.7 加大政策支持力度

疫病的净化需要政府部门的大力支持，把消毒灭源、监测流调、扑杀净化、流通监管、宣传培训等经费列入各级政府预算。尽早淘汰阳性牛并给予适当的经济补贴，对有效控制该病的扩散传播有重要的实践意义。

5.8 加大监督执法力度

各级农业农村主管部门应强化产地检疫的执法力度，健全执法、监督和追责的制度体系，用法律手段堵住活畜无序流通带来的防控漏洞，从源头减少病畜的流动从而控制疫病的传播。

5.9 其他防控措施

通过基因检测选育MAP 抗性牛也是以后防控该病的研究方向之一[9]。另外，近几年有研究[9]发现，镓可以在体外抑制多种MAP 菌株的生长，是目前世界上公认的效果最全面的抗菌剂，含镓制剂有望被开发成有潜力的非传统抗菌药物用于防控MAP。

6 结语

综上所述，该病的防控应以预防为主，尽可能消灭传染源，切断传播途径，阻断易感动物接触病原，从而减少新感染的发生。加强检疫、隔离、淘汰净化是控制该病的有效方法，检疫淘汰措施对于控制该病的流行扩散有积极意义。一旦牛场发病一定要做到早发现早诊断，尽快控制已发病牛群，采取相应防控措施防止该病扩散。一定要重视该病，平时牛场要从犊牛繁育、饲养管理、牛群的抵抗力、引种检疫、生物安全等方面入手；政府部门要加强宣传培训，加大政策支持力度和监督执法力度，多方面采取综合性防控措施防控该病。在该病未来的防控实践中，一定要加强政府层面的防控规划，只有从上到下都切实做好相关的防控工作，形成科学有效的综合性防控体系，才能减少该病的发生并严格控制该病的传播，从而将该病对畜牧业及公共卫生的危害降至最低。