循环肿瘤DNA在肾细胞癌中的研究进展及临床应用

何 为 综述 马潞林 审校

(北京大学第三医院泌尿外科，北京 100191)

肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是泌尿系常见的肿瘤之一，肾脏肿瘤发病率在全美男性及女性分别排名第7、8位，近5年呈持续上升趋势[1]。在我国，RCC同样呈现明显增长的趋势[2]。早期诊断及治疗对肿瘤的控制尤为重要，随着精准医学时代的来临，传统影像学检查方法再也无法满足新的需求，液体活检的价值逐渐提高，循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)检测技术提供了新的思路。本文对ctDNA在RCC中的应用进行文献总结。

1 ctDNA的特点

游离DNA (cell-free DNA, cfDNA)是指在几乎所有的体液(包括血液)中均可检测到的脱细胞核酸的短片段，参与免疫、凝血、衰老、癌变等各种生理病理现象。在癌症患者中，一部分血浆中的cfDNA来源于肿瘤，称为ctDNA，可能与原发肿瘤具有相同的突变和基因改变。ctDNA的定义为肿瘤细胞释放到外周循环系统中携带肿瘤信息的DNA片段，是cfDNA的一种特殊类型，主要来源于肿瘤细胞凋亡、坏死、主动释放、吞噬作用及细胞脱离[3]。

肿瘤患者血液中ctDNA大小受肿瘤细胞释放方式的影响，一般相比于健康人群的cfDNA更片段化，细胞凋亡释放的DNA大小为150～180 bp，在坏死过程中，染色质链以无序的方式降解，可产生50 kbp的片段[3，4]。肿瘤患者血液中线粒体来源cfDNA(mitochondria-originated cfDNA, mt-cfDNA)片段大小与患者肿瘤负荷及ctDNA浓度呈负相关[5]。另外，ctDNA半衰期较短，一般在100～数百分钟，可通过其含量的变化监测疾病进展及治疗情况[6，7]。

由于ctDNA携带特异的肿瘤信息，且半衰期较短，能够通过其携带的信息和含量的变化提供精准的治疗方案，并对治疗情况进行跟踪和随访，与组织标本相比，ctDNA的优点很多：风险小、快速、微创、价格便宜，而且从生物学角度来看，更能代表整个肿瘤，具有广阔的应用前景。但是ctDNA在外周血液中含量极低，检测尤其困难，目前检测方法有：①聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术，包括等位基因特异性PCR(allele specific polymerase chain reaction, AS-PCR)、数字PCR(digital polymerase chain reaction, dPCR)和数字PCR结合流式技术(beads, emulsion, amplification, magnetics, BEAM-ing PCR)；②二代测序技术(next generation sequencing, NGS),包括全基因组测序、逆转录扩增测序和全外显子测序；③有针对性的NGS技术，包括基于多重PCR的NGS和基于混合捕获的NGS；④组合方法[8]。检测的敏感性取决于所使用的评估技术和遗传平台、肿瘤器官、肿瘤分期、肿瘤异质性和克隆性[9]。

2 ctDNA在RCC中的应用

目前，FDA已批准cfDNA应用在非小细胞肺癌和结直肠癌中，分别用于检测血浆中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)的突变情况及SEPTIN9启动子的甲基化状态，并指导靶向药物的应用，在以EGFR为靶点的药物治疗非小细胞肺癌中，还可以监测T790M突变，提示耐药并更换靶向药物。在肺癌、卵巢癌、乳腺癌及结直肠癌根治术后，ctDNA的存在被证明与复发和不良预后相关，甚至通过ctDNA的肿瘤特异性改变预测术后复发率[10, 11]。唐堂等[12]对46例前列腺癌研究显示，ctDNA中携带HR基因突变的患者在诊断时Gleason评分整体更高(P<0.01)，有更多的转移灶(P=0.018)，且肿瘤分期更晚(P=0.031)，此外，胚系HR突变较体系HR突变的患者确诊年龄更小(P<0.01)。

同样，在早期和晚期RCC患者血浆中都能检测到ctDNA，包括在小肿瘤患者的血浆中[13],而且在RCC患者血浆中cfDNA浓度要明显高于健康人群[14, 15]。在转移性肾细胞癌(metastatic renal cell carcinoma，mRCC)患者中，ctDNA阳性率为33%，与肿瘤组织NGS检测结果的一致性达到77%[16]。Zengin等[17]报道839例mRCC中，612例(72.9%)ctDNA基因突变，其中最常见的突变基因为肿瘤蛋白53(tumor protein 53, TP53)(36.9%)、von Hippel-Lindau(VHL)(22.2%)和端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase, TERT)(7.2%)，肿瘤组织样本采集时间越近，基因突变与血液ctDNA突变一致性越高。Hahn等[18]比较19例mRCC肿瘤组织和ctDNA的NGS检测结果，两者一致率仅为8.6%，肿瘤组织的基因突变比例更高，尤其是在DNA修复基因中，也可能是由于2种方式取样时间不同所致，提示ctDNA的NGS检测结果可能更能反映肿瘤基因动态异质性。2种检测方法应相互补充，共同评估肿瘤状态。

2.1 ctDNA在RCC诊断中的应用

RCC患者血浆中cfDNA水平可作为非侵袭性诊断工具，灵敏度63.0%，特异性78.1%[19]。Hauser等[20]报道30例RCC血浆中cfDNA甲基化水平较健康人群明显增高(14.3%～54.3% vs.0～16.7%)，并具有高度的特异性(85.2%～100%)，血清中高甲基化的cfDNA检测可能有助于RCC的诊断，联合多个基因的分析可以明显提高诊断的准确性(60%～74.3%)。Skrypkina等[21]对比27例RCC与15例健康人的血浆样本，结果显示血浆中cfDNA水平结合Ras相关区域家族1A基因(Ras association domain family 1A gene,RASSF1A)、脆性组氨酸三联体和腺瘤性结肠息肉病(adenomatosis polyposis coli，APC)基因的CpG岛甲基化可以作为癌症的非侵袭性诊断标志物(AUC=1)[21]。

Zhao等[22]建立小鼠伴有MET突变的乳头状肾癌(papillary renal cell carcinoma，pRCC)模型，使用卡博替尼进行治疗，检测ctDNA在疾病进展及治疗后的变化，结果显示ctDNA与模型小鼠的疾病进程的一致性。Pal等[23]对169例pRCC肿瘤组织NGS检测，证实MET突变在pRCC中的突变率较高，达到33%，及其潜在的治疗价值。

2.2 ctDNA判断RCC患者的预后

液体活检(包括ctDNA)另一项有前途的应用是确定肾切除术或肾部分切除术后复发的风险，并在后续检查中作为监测的生物标志物，以便更早地发现转移性疾病。在实性肿瘤中，进展期及转移性肿瘤患者血液中ctDNA含量高于早期肿瘤患者[24,25]。Wan等[26]在92例RCC的研究中得出类似的结论，其中17例复发，相比无复发患者，复发者术前后血浆cfDNA水平更高(P≤0.024)，且在COX多因素分析中明确cfDNA水平可作为复发的独立预测因素(P=0.009)。另一项回顾性研究[27](n=100)对比肿瘤组织中矮小同源盒基因2(short stature homeobox 2， SHOX2)甲基化水平，结果显示治疗前血浆cfDNA中SHOX2甲基化水平与肾切除术后高死亡风险相关(P<0.001)。一项44例mRCC的研究[28]显示，18例ctDNA阳性者相较阴性者肿瘤负荷更高(均值8.81 cm vs. 4.49 cm，P=0.04)。

Yamamoto等[29]纳入53例肾透明细胞癌，共检测到16例(30%)38个突变，包括6例TP53突变和5例VHL突变，ctDNA阳性的RCC患者cfDNA片段更小，ctDNA阳性和cfDNA片段化与更差的肿瘤特异性生存率明显相关(P<0.001，P=0.011)，提示ctDNA阳性和cfDNA片段大小可以作为RCC的预后监测指标。Bacon等[16]研究也证实ctDNA阳性患者预后更差，一线治疗后无进展生存期(progression-free survival,PFS)更短。

2.3 ctDNA指导个体化用药

ctDNA水平还可以预测mRCC患者的治疗效果。ctDNA水平的动态变化与mRCC患者接受一线抗程序性死亡受体1(programmed cell death 1, PD1)和抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4 (cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4, CTLA4)联合疗法的治疗反应相关，ctDNA可作为接受一线免疫检查点抑制剂治疗的mRCC患者治疗反应的早期预测因子[30]。Zhang等[31]报道在晚期肿瘤中通过治疗前后ctDNA的动态变化能够预测是否在免疫治疗中获益，比影像学检查更早预测疾病进展。Feng等[32]通过实时荧光定量PCR对18例转移性透明细胞肾细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)在索拉非尼治疗期间6个不同时间点的cfDNA进行监测，治疗过程中cfDNA水平越高，药物反应越差。与疾病进展的患者相比，缓解期或稳定期患者在8～24周cfDNA水平较低。可见，ctDNA可作为免疫检查点抑制剂治疗反应的预测性生物标志物，具有潜在的价值。

Pal等[33]纳入220例mRCC，78.6%的患者检出ctDNA突变，最常见的变异为TP53(35%)、VHL(23%)、EGFR(17%)、神经纤维瘤蛋白1(neurofibromin 1， NF1)(16%)和AT丰富结合域1A(AT-rich interaction domain 1A, ARID1A)(12%)，其中38例和64例分别接受一线药物治疗和二线药物治疗，二线药物治疗患者和一线药物治疗患者基因突变频率差异最大的分别是TP53 (49% vs.24%)、VHL (29% vs.18%)、NF1 (20% vs.3%)、EGFR (15% vs.8%)和磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α基因(phosphatidylinositol- 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA) (17% vs.8%)，ARID1A是相同的(13% vs.11%)，如果将一线和二线治疗药物都限制为血管内皮生长因子抑制剂，基因突变的差异将会更显著，这些差异提示治疗耐药的潜在机制。

目前，正在进行的TARIBO研究是一项Ⅲ期多中心临床研究，通过ctDNA分析评判，mRCC患者在使用靶向药物治疗的前提下，实施减瘤手术能否改善患者长期生存及预后的影响，并探索靶向治疗的耐药机制[34]。

3 ctDNA检测面临的挑战

尽管取得许多新进展，但ctDNA的广泛应用仍面临一些重要的挑战：首先，ctDNA本身的特点，包括片段化、浓度低、半衰期短，对临床应用设置障碍，影响结果的准确性和稳定性。其次，衰老细胞的生物学特征也为ctDNA的应用增加限制，衰老过程中非癌性病变中体细胞突变，增加混杂因素，尤其是在非癌组织中发现与癌组织中非常类似的TP53突变，需要更好地了解健康以及特定生理条件下(例如衰老)外周血中的成分[35]。另外，由于高肿瘤突变负荷与免疫检查点抑制剂的良好反应相关，肿瘤突变负荷被认为是预测免疫治疗疗效的重要标志物，ctDNA可以作为肿瘤突变负荷的替代，并预测患者对免疫治疗的反应[36]。但免疫系统在肿瘤进展的过程对血液中的成分造成改变，需要开发工具，以便能够在检测样本中研究微环境和免疫应答对肿瘤发生的影响。最后，ctDNA在肿瘤患者血浆中的浓度较低，需要对诊断工具进行进一步的改进，以能够检测循环中的少量肿瘤衍生成分。

目前，对于ctDNA的研究大部分为回顾性研究，缺乏前瞻性研究，ctDNA为生物标记的癌症检测和监测方法的开发需要大规模的临床研究和充足的证据，不仅是为检测方法的效率和检测手段的可靠性，而且是为其临床实用性。对于每一种肿瘤靶点，可能需要分析数百名癌症患者。为验证该变异是否为肿瘤组织所特有，还应评估大量健康个体作为对照的cfDNA图谱，对这2组患者进行持续的临床随访也是必要的，以区分假阳性和真阳性信号[37]。

ctDNA检测技术改变了肿瘤的诊断及治疗方案，在个体化精准治疗的时代，为临床工作提供新的决策思路，其应用包括肿瘤的早期发现与诊断、肿瘤发展进程的监测与随访、靶向治疗的选择和免疫治疗反应等方面，具有广泛的前景和应用价值，但因其独特的生物学特点、检测方法和技术的限制，仍需进一步的研究和论证。