糜子萌芽期耐冷种质资源综合评价体系构建

董 扬

(黑龙江省农业科学院齐齐哈尔分院，黑龙江齐齐哈尔 161006)

糜子(PanicummiliaceumL.)是C4作物，能忍受盐碱、干旱、高温等极端条件[1]，是干旱、半干旱地区的重要特色杂粮作物[2]。我国具有丰富的糜子种质资源，目前共收集10 200余份，国家已存储 8 850 余份，尤其是地方品种资源较多[3]，具有广泛的遗传变异性和丰富的抗逆基因[4-5]。糜子的生育期短，是东北等冷凉地区的救灾抗逆作物，在北方有较大的生产优势和地区优势。

植物的耐冷性是指作物个体对低温冷害所表现出的抵抗性或耐受性[6]，是植物对低温逆境而表现出的一种生理应激反应[7]。农业生产中，减轻低温冷害所造成的损失最有效的手段就是选用耐冷品种，而农作物耐冷性评价体系的建立是鉴定和筛选耐冷种质资源的基础与前提[8]。种子在萌发阶段对低温反应最为敏感，低温破坏了种子细胞的生物活性，从而大幅度地降低了种子的发芽势、发芽率、发芽指数等[9]。近些年，在耐冷性鉴定分析评价方法上，前人已经做了大量工作，种子萌发的时间和活力最先受到低温影响[10]。环境温度越低，种子萌发所需的时间越长[9]。长时间的萌发会使种子受到土壤中病原菌的侵害，使种子腐烂，降低发芽率[11-12]。在种子萌发期，发芽率、发芽势、发芽指数、根长、芽长等指标会发生不同程度的变化，是植物受到低温胁迫最直接、具体的表现[13-14]。徐伟豪将冷胁迫14 ℃条件下水稻芽期的发芽率设置5个耐冷评价标准，发芽率>90%为极强，80%<发芽率≤90%为强，70%<发芽率≤80%为中，60%<发芽率≤70%为弱，发芽率≤60%为极弱[15]。Marocco等的研究表明，玉米的最适生长温度为 25～28 ℃，在温度低于10 ℃时植株生长会变得明显缓慢，6～8 ℃ 时就不再生长发育[16]。王俊娟等的研究表明，棉花最低萌发温度为10～12 ℃，最适温度为 20～30 ℃[17-18]。辣椒的适宜发芽生长温度在20～30 ℃ 之间，长时间在12 ℃以下生长会受到冷害[19]。唐双勤等设计 5、8、10 ℃等3 个低温处理直播籼稻，结果表明 8 ℃处理最适鉴别品种间耐冷性差异[20]。杨光等对296份玉米自交系进行了耐冷性鉴定研究，结果表明在4 ℃低温下，yw9706自交系全部发芽，而自交系龙抗11完全没有发芽[21]，说明同一作物不同品种间耐冷性存在差异。糜子种子发芽最适温度为20～30 ℃[22]，当温度低于 12 ℃ 时容易对糜子造成冷害胁迫[23]。

目前，对糜子的研究主要集中在抗旱、抗倒伏和抗盐碱等抗逆方面[24-26]，对耐冷能力的研究鲜见报道。本研究以240份糜子种质资源为参试材料，通过逐级低温筛选，确定糜子的最低发芽温度，通过萌发期不同低温处理，调查耐冷性相关指标，并利用模糊数学隶属函数、正态分布检验、相关性分析、主成分分析等统计方法进行综合分析，以期建立糜子耐冷性综合评价体系，为耐冷糜子品种资源的鉴定提供方法，并对资源加以利用。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2021年在黑龙江省农业科学院齐齐哈尔分院实验室内进行，该科研基地(123°45′E，47°15′N)位于黑龙江省西部干旱半干旱地区，海拔141 m，年平均气温为3.37 ℃，积温为2 600～2 700 ℃，生长季总降水量为415 mm。试验材料是从适宜在该科研基地种植的820份糜子品种资源中，根据2017—2019年测量的株高、落粒性、穗质量、千粒质量等农艺性状和产量性状指标初步筛选出的240份优质糜子资源，选种以来源广泛、适宜当地种植、成熟度好、农艺性状和产量性状突出为原则。

240份糜子资源来自21个国家，其中我国资源209份，国外资源31份，我国资源中包括新疆11份、山西27份、宁夏16份、陕西16份、青海10份、内蒙古33份、黑龙江31份、辽宁8份、西藏1份、吉林8份、云南2份、山东7份、江苏3份、甘肃17份、湖北1份、海南2份、北京3份、河北13份。

1.2 试验设计

将糜子种子在1%的NaClO溶液中消毒15 min后，用自来水冲洗5 min，将种子置于阴凉通风处阴干后置于铺有3层滤纸的大号培养皿中，每个培养皿中均等摆放籽粒饱满、大小颜色一致的种子30粒。将培养皿置于人工气候箱内，每个试验均设置3次重复。设25 ℃(对照)及12、10、8、6、4 ℃ 6个温度处理试验，黑暗24 h，设置湿度为70%。

1.2.1 耐冷种子最低发芽温度试验方法 将240份糜子资源逐级放入25、12、10、8、6、4 ℃中筛选，25、12、10 ℃处理的发芽率以80%为标准，发芽率≥80%的资源进入下一水平低温处理，8、6、4 ℃处理的发芽率以60%为标准，发芽率≥60%的资源进入下一水平低温处理。

1.2.2 最适低温筛选试验方法 为确定糜子萌发期耐冷性鉴定的最适温度，根据不同地域来源从供试糜子资源中随机选出25份材料，分别于25、12、10、8、6 ℃(试验“1.2.1”节确定出的最低发芽温度)5个温度条件下处理10 d，之后转入25 ℃条件下恢复生长6 d。每个试验均设置3次重复。低温胁迫处理期间无光照，生长恢复阶段07：00—19：00光照，每天12 h，设置2 500 lx的光照强度和70%的相对湿度。每天记录发芽过程中的发芽粒数，计算发芽指数，生长恢复第3天测定发芽势，第6天测发芽率，并计算活力指数。

1.2.3 萌发期耐冷性鉴定试验 将240份糜子资源分别放在10 ℃(最适低温筛选温度)和25 ℃(对照)2个温度条件下萌发，培养方法同“1.2.2”节。发芽过程中每天记录发芽粒数，计算出发芽指数，恢复生长第3天测定发芽势，第6天测定发芽率、根长、根鲜质量、芽长、芽鲜质量，计算活力指数和冷害率等。根长为从种胚到最长根尖的长度；芽长为从种胚到最长叶尖的长度。萌发期生长指标计算公式如下：发芽势=第3天发芽种子数/处理种子数×100%；发芽率=第6天发芽种子数/处理种子数×100%；发芽指数=∑(第n天的发芽种子数/相应发芽天数)；活力指数=发芽指数×胚根鲜质量；发芽相对冷害率=(对照发芽率-处理发芽率)/对照发芽率×100%；相对值=各指标处理值/对照值。

1.3 数据处理与分析

用Excel 2019软件进行数据统计分析，用SPSS 19.0软件进行相关性分析、主成分分析，用R studio软件进行聚类分析。

采用标准差系数赋予权重法[27]进行耐冷性综合评价：采用公式(1)计算隶属函数值，用公式(2)计算标准差系数，用公式(3)计算各指标的权重，用公式(4)计算各材料的综合评价值。

(1)

式中：U(Xj)表示第j个指标的隶属函数值；Xj表示第j个综合指标；Xmin表示第j个综合指标的最小值；Xmax表示第j个综合指标的最大值。

(2)

(3)

(4)

式中：D表示各品种用综合指标评价所得的综合评价值。

2 结果与分析

2.1 低温萌发温度评价

2.1.1 糜子萌发期最低发芽温度的确定 对240份糜子资源进行逐级降温筛选，结果(图1)表明，在25 ℃萌发时出芽率均大于98%，说明参试糜子资源种子质量良好，因此全部进行逐级低温发芽试验。在12 ℃温度下发芽率大于80%的糜子资源有195份，占总数的81.25%，195份资源在10 ℃培养箱中发芽率大于80%的糜子资源有164份，占总数的68.33%，164份资源在8 ℃培养箱中发芽率大于60%的资源有84份，占总数的35.00%，将筛选出的84份糜子放入6 ℃培养箱中发芽，结果显示发芽率大于60%的糜子资源有22份，占总数的9.16%，22份糜子资源在4 ℃培养箱中均没有发芽。因此，糜子萌发期最低发芽温度为6 ℃。

2.1.2 不同低温处理下各指标的耐冷响应 由表1可知，在12、10、8、6 ℃低温胁迫下，25份糜子资源的4个发芽性状均表现出不同程度的下降趋势，且各指标的相对值大部分都小于1，平均值均小于1，说明4个低温处理对25份糜子的萌发均造成一定程度的冷害，并且相对发芽势的变异系数范围为9.12%～113.14%，相对发芽率的变异系数范围为7.10%～89.42%，相对发芽指数的变异系数范围为8.01%～94.33%，相对活力指数的变异系数范围为17.12%～105.00%，表明测定的指标对4个低温反应敏感，通过对供试材料萌发期相对指标的统计分析可知，25份抽选样本的遗传多样性较高，能够代表240份参试糜子材料，可以进一步分析以确定糜子耐冷性评价的最适温度。

2.1.3 确定最适耐冷性评价温度 确定筛选耐冷糜子资源的最适低温，用隶属函数法计算出25个糜子资源在4个低温下的芽期指标综合得分(D)(表2)，对D进行正态分布检验和QQ-Plot分析(图2)。

表1 不同低温处理下25份糜子材料的萌发表现

从图2-A可以看出，12、10、8 ℃正态分布检验的峰度值分别为-0.90、-0.72、-1.46，均小于0，呈平顶峰，6 ℃处理下的峰度值为1.46，大于0，呈尖顶峰，10 ℃的峰度值最接近于0，6 ℃正态检验偏度值为1.36，呈较大程度的正向偏离，12、10、8 ℃的偏度值分别为 -0.62、-0.12、-0.43，均小于0，呈负向偏离。结果表明10 ℃处理下的偏度绝对值仅为0.12，是所有处理中偏度最小的，正态分布拟合度最高。隶属函数的QQ-Plot分析结果(图2-B)表明，25份糜子材料在10 ℃处理下相对发芽势、相对发芽率、相对发芽指数和相对活力指数的隶属函数值与趋势线拟合度最高(R2=0.985)，最符合正态分布。所以，10 ℃处理为筛选耐冷糜子资源的最适温度。

2.2 萌发期耐冷性评价

2.2.1 萌发期糜子资源对冷胁迫的响应 从表3可以看出，在10 ℃条件下240份糜子品种资源萌发期的各项指标与对照比的相对值大部分都小于1，平均值均小于1，说明10 ℃低温处理对参试材料的萌发造成了一定程度的冷害。相对发芽势的范围为0.00～1.00，相对发芽率的范围为0.08～1.00，相对发芽指数的范围为0.02～0.38，相对芽长的范围为0.09～0.93，相对根长的范围为0.21～2.98，相对芽鲜质量的范围为0.03～1.33，相对根鲜质量的范围为0.18～2.13，相对活力指数的范围为0.02～0.69，相对发芽冷害率的范围为0.00～0.92。其中，相对根鲜质量、相对活力指数、相对发芽冷害率的差异性较大，变异系数分别是43.33%、58.45%、100.03%。表明不同品种资源的耐冷性存在差异，具有丰富的遗传多样性，参试材料的测定指标对 10 ℃ 低温胁迫反应敏感，测试材料可作为在冷胁迫下鉴定耐冷性状的品种资源。

2.2.2 萌发期冷胁迫下各性状的相关性分析 从相关性分析结果(表4)可以看出，相对发芽势、相对发芽率、相对发芽指数分别与相对芽鲜质量、相对根鲜质量、相对活力指数、相对冷害率等指标间呈极显著负相关(P<0.01)；相对根长与相对发芽率呈显著正相关(P<0.05)，与相对芽鲜质量、相对根鲜质量、相对活力指数、相对冷害率呈显著负相关(P<0.05)，与相对芽长、相对发芽指数、相对发芽势呈极显著正相关(P<0.01)；相对发芽势、相对发芽率、相对芽长、相对发芽指数这4个指标相互间均呈极显著正相关(P<0.01)；相对根鲜质量、相对芽鲜质量、相对活力指数、相对冷害率这4个指标相互间均呈极显著正相关(P<0.01)。相对发芽势、相对发芽率和相对发芽指数相互间的相关系数均大于0.80，相对芽鲜质量、相对活力指数和相对根鲜质量相互间的相关系数均大于0.90，说明各性状间受到冷胁迫后的响应是相互关联的。

表3 萌发期10 ℃冷胁迫下各性状相对值的统计分析结果

表4 萌发期冷胁迫下各性状相对值的相关系数

2.2.3 萌发期冷胁迫下糜子测量性状相对值的主成分分析 对240份糜子冷胁迫下9个相对性状进行主成分分析，选取3个特征值大于1的主成分。由表5可知，第1主成分的贡献率为52.57%，第2主成分的贡献率为22.87%，第3主成分的贡献率为11.78%，累计贡献率为87.22%，表明3个主成分涵盖了9个相对指标87%以上的数据信息。由表6可知，9个性状相对值的变化趋势可以通过前3个主成分代表，它们之间的相关性可通过因子载荷量反映出来。 第1主成分与相对发芽势、相对发芽率和相对发芽指数呈较大的正相关，表明冷胁迫下糜子发芽性状可作为耐冷性评价的重要指标。第2主成分与相对芽鲜质量和相对根鲜质量呈较大的正相关，表明冷胁迫与种子发芽后的鲜质量有较大关系。第3主成分与相对根长呈较明显的正相关，表明根长对其起主要作用。

表5 3个主成分的特征值以及贡献率

表6 各因子载荷矩阵

3 讨论

3.1 糜子耐冷温度评价

近年来，各国学者对不同农作物种子萌发期耐冷性方面做了大量研究。张鹤等采用模糊数学隶属函数方法研究认为，花生萌发期进行耐冷性评价最佳耐冷温度为6 ℃[28]；孙世臣等研究发现，寒地水稻耐冷性评价最适温度为10 ℃[29]。虽然前人对多种作物种子萌发期的耐冷性做了大量研究，但在处理糜子的耐冷低温和评价指标上还未见报道，因此，确定糜子耐冷性评价的适宜温度条件是进行糜子耐冷性鉴定工作的前提。本研究以240份糜子种质资源为参试材料，分别在 25、12、10、8、6、4 ℃的低温条件下处理，逐级筛选后发现，部分糜子可在6 ℃发芽，而在4 ℃条件下未见发芽，因此在25、12、10、8、6 ℃的温度下，对根据不同地域来源随机选出25份材料进行处理，分别测定低温条件下的相对发芽势、相对发芽率、相对发芽指数和相对活力指数作为评价指标，利用标准差系数赋予权重法、标准正态分布检验和QQ-Plot对数据进行分析，结果显示在6、8 ℃低温条件下萌发糜子对种子的活力影响较大，无法对耐冷能力进行准确判断；在12 ℃低温条件下种子萌发对活力的影响较小， 品种间的差异并不显著；10 ℃处理后的各项活力指标均呈明显的正态分布，且品种间差异显著。因此，在低温10 ℃时对糜子种子做耐冷发芽试验可作为糜子种质资源的耐冷性鉴定条件。糜子耐冷性筛选的最适温度与寒地水稻[29]、玉米杂交种[30]等相同，但与花生[28]和高粱[31]等作物相比有所提高。说明不同作物的最适耐冷性评价温度存在差异。

3.2 糜子萌发期耐冷性状评价

目前还未见有糜子资源萌发期耐冷性状的评价。袁雨豪等对100份糜子资源通过盐胁迫测定萌发期的发芽率、发芽势、发芽指数等指标，通过主成分分析，确定糜子萌发期耐盐性鉴定性状指标[26]。本研究以240个糜子品种资源为试验材料，测定 10 ℃ 低温胁迫下糜子萌发期的相对发芽率、相对发芽势、相对冷害率等指标(以25 ℃为对照)，通过相关性分析，发现耐冷性状之间受到冷胁迫的程度是相互关联的。主成分分析后将发芽率、发芽势和发芽指数作为糜子萌发期耐冷性的鉴定指标，与油菜[32]、水稻[33]等作物的耐冷性鉴定指标有一定相似性。

4 结论

通过逐级降温法发现部分糜子的最低发芽温度为6 ℃，利用标准差系数赋予权重法计算综合隶属函数值，通过正态分布等确定最适耐冷性评价温度，结合主成分分析建立糜子资源萌芽期耐冷综合评价体系：在萌发期，10 ℃处理，以发芽率、发芽势和发芽指数作为耐冷性鉴定指标。