响应面法优化苍术挥发油提取工艺及其抑菌活性研究＊

2022-12-09张科艺马文敏

科技与创新 2022年23期

赵彪，张科艺，马文敏，王洋

（1.商洛学院生物医药与食品工程学院，陕西商洛 726000；2.商洛学院商洛市中药材病虫害综合防治技术研究中心，陕西商洛 726000；3.商洛学院陕西秦岭特色生物资源产业技术研究院，陕西商洛 726000；4.东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150036）

苍术是菊科植物茅苍术（Atractylodes lancea（Thunb.）DC.）或北苍术（Atractylodes chinensis（DC.）Koidz.）的干燥根茎，作为中国著名的野生中药材，始载于《神农本草经》，被列为上品[1]。苍术主要含苍术素、苍术醇、β-桉叶醇、苍术内酯、茅术酮等挥发性成分[2-4]，司燥湿健脾、明目之功，主治湿阻中焦、脘腹胀满、泄泻、水肿、脚气痿躄、风湿痹痛、风寒感冒、夜盲和眼目昏涩[1，4]。苍术挥发油内含多种药理活性成分[5]，本研究以苍术为主材料，对其挥发油的提取工艺进行研究。苍术挥发油的提取在中药制剂和生产中是一个难点。中国挥发油提取的传统方法为水蒸气蒸馏法，但其提取需高温蒸馏，导致挥发油中含有的热不稳定成分损失较多，严重影响其药用活性。现今挥发油提取技术趋向于多技术联用[6]，故本研究拟用减压辅助水蒸气蒸馏法提取挥发油，通过调控真空度，降低溶剂水的沸点，使其处于低温沸腾状态，从而减少热不稳定成分的损失。

1 材料与设备

1.1 实验材料

苍术（产地：商洛，购于致天然旗舰店）；红四氮唑（TTC），飞净生物科技有限公司；无水硫酸铜，天津市大茂化学试剂厂；MH肉汤，海博生物技术有限公司；可溶性淀粉，天津市致远化学试剂有限公司；琼脂粉，天津市致远化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

高压蒸汽灭菌锅（ANYO），旋转蒸发仪（EYELAN-1001），高低温震荡培养箱（HZQ-F160C型），紫外分光光度计（美析UV1100），超净工作台；手提式中药粉碎机，电子天平（舜宇FB323），标准检验筛。

2 方法

2.1 苍术挥发油单因素条件的筛选

将用于测定的供试品粉碎，后过2-3号筛。以水蒸气蒸馏法联用减压技术建立最佳提取工艺，主要考察辅助压力、液料比、提取温度、提取时间4个因素对挥发油产率的影响[7]，以各项中最优条件作为后续的提取条件，每组3次重复。

辅助压力的单因素实验：称取20 g苍术粉置于圆底烧瓶中，加入10倍体积的水，辅助压力分别设置为0.1 MPa、0.09 MPa、0.08 MPa、0.07 MPa、0.06 MPa、0.05 MPa，在90℃下蒸馏5.0 h，馏出液加入5 g无水硫酸钠，抽滤后回收溶剂，称量质量，并计算挥发油得率[8]。

参照辅助压力实验，分别在1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14的液料比下，50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃的温度梯度下，1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h的时间梯度下，进行单因素实验。

2.2 Box-Behnken设计响应面优化提取工艺

2．2．1 响应面实验因素及水平确定

根据单因素实验结果，选取对挥发油产率影响较大的3个因素及每一因素的前3个水平作为响应面设计的三因素三水平。

2．2．2 Box-Behnken实验设计方案

将确定的三因素三水平输入Design-Expert 8.0.6 Triar软件的Box-Behnken中心组合设计中，根据Box-Behnken原理得到实验方案，依照方案进行实验。

2．2．3 响应面的优化分析及验证

以苍术挥发油产率为响应值，进行二次响应面回归分析，得回归方程，方程中各项系数的正负反映各因素对响应值的影响方向，绝对值大小反映影响程度[9-10]。响应曲面坡度越大，则对响应值的影响越大。开口朝下，表明该因素发展水平具最优值，可进行响应优化。等高线图是曲面上相同的因素值在底面上形成的曲线，等高线越趋近于正圆，则两因素的交互作用越小；等高线越趋近于椭圆，则两因素的交互作用越大。等高线的密集程度反映了该因素对产油率的影响程度，等高线越密集，对出油率的影响就越大[11]。

2.3 抑菌活性测定

配置256 mL/L药液、肉汤培养基（含TTC），将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌活化后分别接种，37℃恒温振荡培养20 h，紫外分光光度计测量细菌浓度，使菌悬液OD600=0.5。将菌悬液稀释100倍。在96孔板上采用二倍稀释法配置系列浓度溶液[12]，依次加入2种稀释菌悬液，培养12 h，观察孔板颜色，确定最小抑菌浓度MIC。

3 结果

3.1 单因素实验结果

由各单因素对产率影响结果可知，蒸馏时间在2.5 h后对产率影响较小，故选择3.0 h作为提取时间；选取辅助压力0.06～0.08 MPa、料液比1∶6～1∶10、温度60～80℃作为后续Box-Behnken响应面法优化数据。

3.2 响应面实验因素及水平确定

根据单因素实验结果，设定提取时间为3.0 h，选取对苍术挥发油产率影响较大的辅助压力、料液比、温度3个因素，确定三因素三水平，因素水平表如表1所示。

表1 苍术挥发油提取的响应面实验因素水平表

3.3 响应面实验方案及结果

以苍术挥发油产率作为响应值，Box-Behnken中心组合设计方案及结果如表2所示。

表2 BOX-Behnken实验设计及结果

3.4 模型建立与回归分析

运用Design-Expert软件，以苍术挥发油产率为响应值，进行二次响应面回归分析，获得回归方程：苍术挥发油产率=2.61-1.375×10-3A-0.026B-0.26C+4.5×10-3AB+0.15AC-0.072BC-0.29A2-0.28B2-0.38C2，由该方程可知提取温度对响应值的影响大于辅助压力、大于料液比，该二次项系数均为负值，则方程图像开口向下，具有最高点，故能进行优化。

苍术挥发油提取回归模型的显著性检验结果如表3所示。

由表3知，该模型的F值为69.01、P小于0.000 1，表明模型是极显著；C、A2、B2、C2对响应值P均小于0.000 1，说明C、A2、B2、C2对模型具有极显著的影响，交互项AC、BC的P值小于0.05，说明对模型具有显著的影响。矢拟项Prob大于F值，为0.458 3，大于0.05，说明拟合的回归曲线符合实际情况，可以用此模型分析和预测苍术挥发油的提取率。