蛋白酪氨酸激酶2/信号转导和转录活化因子3信号通路在局灶节段性肾小球硬化小鼠模型中的机制研究

顾凤娟, 徐子斌, 许云鹏, 张燕子, 李丽香, 隋晓露,邹杰锋, 曾启城, 谢婷妃, 陈继红

(1. 广东省深圳市宝安区石岩人民医院 肾内科, 广东 深圳, 518000;2. 南方医科大学附属深圳宝安医院 肾内科, 广东 深圳, 518000)

局灶节段性肾小球硬化(FSGS)是导致终末期肾病(ESRD)的主要原因之一[1]。足细胞损伤是FSGS发生及发展的核心病理环节[2]。研究[3]发现，采用传统的5/6肾切除术模型建立FSGS模型的稳定性较差，很难建立典型的FSGS病理类型。构建成模率高且具备更典型FSGS病理改变的动物模型将有利于探讨足细胞损伤导致FSGS疾病进展的致病机制。蛋白酪氨酸激酶2/信号转导和转录活化因子3(JAK2/STAT3)信号通路介导多种细胞因子和生长因子的细胞内信号传递的共同途径，活化相应靶基因，参与机体免疫反应、血管细胞迁移增殖和细胞凋亡等，并广泛参与糖尿病肾病、狼疮性肾炎等肾脏病的发生与发展，但在影响FSGS进展的机制研究中仍有待深入探讨。本研究针对C57BL/6小鼠进行精准化的5/6肾切除术，建立典型FSGS病理改变小鼠模型，探讨JAK2/STAT3信号通路影响FSGS进展的可能机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究材料

选取6周龄雄性C57BL/6小鼠(购自北京维通利华动物实验有限公司)60只，基础饲料适应性饲养1周，随机分为FSGS组(n=30)和对照组(n=30)。FSGS组小鼠在开腹后接受精准化5/6肾切除术，建立FSGS小鼠模型; 对照组为假手术组，仅暴露双侧肾脏，剥离肾周脂肪组织，而后复位缝合。本研究通过医院动物伦理委员会审批(实验编号: 2022-600)。

1.2 模型建立

1.2.1 FSGS组: 建立精准化5/6肾切除模型。通过直接减少肾单位建立FSGS模型，需排除肾盂所占体积，小鼠肾盂体积约占肾脏总体积的15.75%[4]。假设切除体积为y, 列方程(1-y-15.75%)/(1-15.75%)=1/3, 解出y=56%, 即切除左肾肾盂外2/3的肾组织，需分别切除离左肾上极及下极28%的肾脏总体积。肾脏总体积计算采用椭球公式[5], 即V=A×B×C×4/3π; 结合椭球缺体积公式[6], 即V=[π×A×B×(d+C)2][3-(d+C)/C]/3C;A、B、C分别为1/2宽、1/2厚、1/2长,d为1/2长减去单极切除的长度。假设d=xC, 即(1-28%)A×B×C×4/3π=[π×A×B×(xC+C)2][3-(xC+C)/C]/3C, 最终解出x=35%, 即分别在离左肾上极和下极35%最大长径处进行切除，可切除左肾各约1/3的体积。

1.2.2 对照组: 对照组为假手术组，仅暴露双侧肾脏，剥离肾周脂肪组织后复位缝合。

1.2.3 术后重症加强护理病房护理: 室温25 ℃, 湿度55%, 术后连续3 d注射青霉素以预防感染。

1.2.4 建模成功标准: 小鼠24 h尿蛋白定量>100 mg, 苏木精-伊红(HE)染色显示FSGS典型病理改变，判定造模成功。

1.3 观察指标

术前和处死前1 d, 代谢笼收集并记录小鼠24 h尿量。颈静脉采血1 mL备用。术后10周处死小鼠，留取肾组织备用。

1.3.1 生化指标: 应用全自动生化分析仪检测24 h尿蛋白、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)。

1.3.2 肾组织病理学: 留取肾组织，采用10%福尔马林固定，脱水、石蜡包埋、切片，HE染色观察肾组织病理学改变情况。

1.3.3 采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测肾组织JAK2mRNA、STAT3mRNA的表达: 取约100 mg肾脏皮质组织，充分研磨，使用Trizol提取总RNA, 使用反转录酶M-MLV(购自美国赛默飞世尔科技公司)将RNA反转录合成cDNA, 引物设计见表1。采用RT-qPCR仪(美国ABI), 并按下列条件进行扩增反应: 95 ℃预变性15 min, 95 ℃变性10 s, 60 ℃退火延伸30 s, 72 ℃延伸30 s, 共45个循环。采用2-△△CT方法，以GAPDH作为内参照，计算JAK2mRNA、STAT3mRNA的表达量。

表1 JAK2、STAT3的引物序列

1.3.4 采用Western Blot检测肾组织磷酸化酪氨酸激酶2(p-JAK2)、JAK2、磷酸化信号转导和转录活化因子3(p-STAT3)、STAT3的蛋白表达: 取肾脏皮质组织约100 mg, 加入蛋白质裂解液提取组织蛋白, 100 ℃水浴变性5 min, 上样、电泳、转膜，封闭2 h, 加入稀释的一抗(p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、内参抗体浓度为1∶1 000, 美国CST)4 ℃孵育过夜，二抗(浓度1∶10 000, 美国CST)室温孵育2 h。采用电泳凝胶成像仪进行显色，采用Image J软件，以目的蛋白灰度值与内参灰度值的比值计算p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3的蛋白相对表达量。

1.3.5 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子-β1(TGF-β1)水平: 取约100 mg的新鲜肾脏样本，置于匀浆器内充分研磨, 4 ℃下以5 000转/min离心5 min, 取上清，按ELISA试剂盒方法检测各组IL-6、MCP-1、α-SMA、TGF-β1水平。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 2组小鼠生化指标水平比较

与同组术前及对照组术后10周相比, FSGS组术后10周的24 h尿蛋白、Scr、BUN水平较高，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 FSGS组与对照组术前及术后10周的生化指标水平比较

2.2 2组小鼠肾组织的病理学变化比较

HE染色结果显示，对照组小鼠肾小球结构清晰、完整，肾小管和肾间质结构正常，无明显损伤。与对照组相比, FSGS组小鼠HE染色可见系膜区基质增生，大量肾小管上皮细胞发生凋亡、坏死、脱落或空泡样变性，肾间质可见炎症细胞浸润，肾小囊腔扩张，肾小球代偿性肥大及局灶性硬化，系膜细胞和系膜基质增生，节段加重，毛细血管袢受压狭窄，局部消失。见图1。

2.3 2组小鼠造模结果

造模过程中, FSGS组有1只小鼠死于麻醉，予以排除。FSGS组其余29只小鼠在造模过程中死亡3只，死亡率为10.3%; 对照组小鼠在造模过程中死亡1只，死亡率为3.3%。

2.4 2组小鼠肾组织JAK2 mRNA、STAT3 mRNA的表达水平比较

术后10周, FSGS组小鼠肾组织JAK2mRNA、STAT3mRNA表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

2.5 2组小鼠肾组织p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表达水平比较

术后10周, FSGS组小鼠肾组织p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图3、图4。

2.6 2组小鼠肾组织IL-6、MCP-1、α-SMA、TGF-β1水平比较

术后10周, FSGS组小鼠肾组织IL-6、MCP-1、α-SMA、TGF-β1水平高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)。见图5。

3 讨 论

FSGS是常见的原发性肾小球疾病，病变呈进行性进展，最终可发展为ESRD。FSGS的发病机制复杂，与遗传因素、足细胞损伤、血流动力学改变、循环因子、细胞凋亡等密切相关[7]。足细胞损伤是FSGS发生及发展的关键环节，当各种因素导致的足细胞损伤比率超过残存足细胞代偿能力时，最终会出现肾小球硬化，导致FSGS的发生。FSGS肾病模型有传统5/6肾切除模型、阿霉素模型[8]、白喉毒素模型等。传统5/6肾切除术模型是较为常用的肾病模型，缺点是对手术操作要求较高，手术切除的体积差异对模型稳定性影响较大[9]。本研究在传统肾切除术基础上，利用数学公式达成精准化切除，成功建立5/6肾切除术模型。该模型可精准测量肾脏长度及确定切除的位置，偏差较小，模型稳定性好，成功率高[10]。

JAK2/STAT3信号通路可被多种细胞因子和生长因子如干扰素-γ(IFN-γ)、IL-6、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等激活，参与免疫、炎症反应及细胞增殖、分化和凋亡等[11]。白蛋白、糖基化终产物、高糖等可激活体外培养的近端肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞JAK/STAT信号通路，引起肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞分化和纤维连接蛋白合成增加，参与FSGS的发生与发展[12]。本研究结果显示，与对照组相比, FSGS组肾组织JAK2/STAT3信号通路中JAK2mRNA、STAT3mRNA和p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表达水平均升高，提示JAK2/STAT3信号通路的激活参与了FSGS的发生与发展。研究[13]显示, JAK2抑制剂AG490可阻断JAK/STAT信号通路，减轻小鼠阿霉素肾病蛋白尿、肾小球硬化、肾小管损伤、炎症细胞浸润并抑制肾脏纤维化，延缓FSGS的发展。足细胞中STAT3的过度激活与肾小球疾病有关，其下调可抑制成纤维细胞活化，减轻由肾毒性血清、艾滋病相关性肾病和糖尿病肾病引起的肾小球疾病，通过抑制JAK2/STAT3信号通路可延缓FSGS的发展[14]。

JAK2/STAT3信号通路与炎症反应、纤维化反应密切相关。本研究结果显示, FSGS组小鼠肾组织JAK2/STAT3信号通路下游炎症因子及纤维化因子IL-6、MCP-1、α-SMA、TGF-β1水平升高，提示JAK2/STAT3信号通路活化并通过促进炎症反应、肾组织纤维化参与了FSGS的发生及发展过程。分析其作用机制为: ① JAK2/STAT3信号通路激活, IL-6表达水平明显升高, IL-6是JAK2/STAT3信号通路的诱导剂，与细胞膜IL-6受体结合能诱导JAK2/STAT3信号通路活化，以正反馈的形式促进炎症反应的发生，诱导肾小球内皮细胞、足细胞损伤，导致肾间质纤维化形成[15-16]。② JAK/STAT信号通路可将IL-6、肿瘤坏死因子等多种炎症因子信号传递至巨噬细胞，刺激细胞表面受体发生免疫应答，导致巨噬细胞浸润。巨噬细胞活化后分泌多种炎症因子，包括MCP-1等，诱导肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转化和凋亡[17], 加剧FSGS发展。③ STAT3抑制剂干预后可诱导α-SMA(+)的肌成纤维细胞凋亡，并抑制肾间质中α-SMA、纤维连接蛋白及Ⅰ型胶原的表达，减轻细胞外基质沉积[18]。TGF-β1可促使足细胞损伤、凋亡及肾小球硬化，导致肾脏纤维化。JAK2/STAT3信号通路活化可能通过增加α-SMA、TGF-β1的表达而导致肾小球细胞外基质沉积、肾小球基底膜增厚以及足细胞数量减少[19], 引起肾小球硬化和肾间质纤维化，参与FSGS的发生及发展[20]。

综上所述，本研究通过精准化5/6肾切除术成功建立小鼠FSGS模型，而JAK2/STAT3信号通路活化可通过促进炎症反应、肾组织纤维化等多种途径参与FSGS的发生及发展过程。