接种微生物对采矿伴生黏土中植物生长的影响

2022-12-08黄剑威宋子恒毕银丽杨惠惠张延旭

西安科技大学学报 2022年6期

黄剑威，宋子恒，毕银丽，3，杨惠惠，张延旭

（1.国能宝日希勒能源有限公司，内蒙古呼伦贝尔 021000；2.中国矿业大学（北京）煤炭资源与安全开采国家重点实验室，北京 100083；3 西安科技大学西部矿山生态环境修复研究院，陕西西安 710054）

0 引言

中国东部草原处于“三屏四带”生态格局北部区域，在保障中国北方生态安全具有重要作用，煤炭资源丰富，区域大规模露天开采对生态环境造成干扰和损伤，严重威胁当地生态安全，亟需复垦修复[1]。由于草原矿区土层瘠薄，在复垦覆土时表土亏缺，无法满足复垦需要，急需开发表土替代基质。通常复垦工程中就地取材利用或改造排弃岩土剥离物、废弃物等作为表土替代材料是一种相对经济可行的方案。宝日希勒矿区在采矿剥离过程中有一层16～20 m厚的采矿伴生黏土，赋存量大且具有较丰富的营养，是一种较好的潜在替代材料。但是由于其物理结构性差、粘性强、微生物活性低等原因，不利于植物生长。为满足复垦需求，前期有研究通过沙黏土配比添加等手段，取得了一定效果[2-3]。如何通过更为简便的方法对伴生黏土进行直接利用改善土壤、促进植物生长，微生物修复技术为矿区复垦工作提供了新的动力和工具。近年来微生物技术因其绿色、高效、低成本、可持续等特点逐渐成为矿区修复研究热点。土壤中有益微生物如解磷细菌，针对土壤磷亏缺特点，可帮助植物将不溶性磷转化为可溶性磷，在农林业生产中有着广泛的应用；丛枝菌根真菌在生态系统养分循环中起着关键作用，有利于植物对不同环境胁迫的抗性[4-5]。目前关于解磷菌和丛枝菌根的研究相关研究成果不尽一致。解磷菌、丛枝菌根真菌可有效促进植物生长，增加土壤微生物活性和磷元素的转化率，但解磷菌仅在一定条件下发挥作用[6-7]。目前研究主要针对常规农田土壤或一般土质，缺少采矿伴生高黏性土壤基质条件下丛枝菌根真菌、解磷细菌等对植物生长、土壤酶活性影响研究。结合宝日希勒矿区采矿伴生黏土特性，通过盆栽试验，选择适于矿区种植、可作为露天排土场复垦区经济作物玉米为供试植物，以采矿伴生黏土为基质，研究伴生黏土基质接种解磷菌和丛枝菌根对植物生长和土壤性质的影响，研究可为露天采矿伴生黏土复垦和微生物改良提供技术借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

露天矿采矿伴生黏土取自内蒙古呼伦贝尔草原的宝日希勒露天煤矿，土壤基础性状见表1。将黏土风干、粉碎，过2 mm筛。土样经高温高压蒸汽灭菌（121 ℃，2 h），风干后，将土均匀放置于试验塑料盆（上口径21 cm、下内径14 cm、盆高20 cm），每盆5 kg。种植玉米品种为品糯28，试验使用的丛枝菌根真菌菌种为摩西管柄囊霉（Funneliformismosseae，BGC XJ01），菌剂由含侵染根段、孢子和沙土混合物组成。所用解磷细菌为斯式泛菌（Pantoeastewartii），由中国矿业大学（北京）微生物复垦实验室从宁夏粉煤灰样品自主分离并纯化培养，将菌株活化后添加入相应处理。

表1 黏土土壤性状

1.2 试验设计

试验在中国矿业大学（北京）微生物复垦实验室人工温室内进行。设计4种微生物接种处理：Funneliformismosseae（AMF）、Pantoeastewartii（PSB）、Funneliformismosseae+Pantoeastewartii（AMF+PSB）、CK。温室内日间空气温度维持35 ℃左右，空气相对湿度为70%～80%。栽种前土壤浇水至最大持水量，水分自然平衡24 h。挑选颗粒饱满的玉米种子，用10% H2O2溶液浸泡10 min消毒，置于恒温箱内25 ℃催芽24 h后播种于盆中，埋深3～5 cm，每穴3株。栽种时AMF处理于玉米根部加入50 g菌剂，PSB处理每盆加入20 mL活化解磷细菌溶液，未接种AMF的处理加入50 g灭活的AMF菌剂，未接种PSB处理加入20 mL灭活解磷细菌培养液。播种后将装置放于温室内培养，采用自然光照。待玉米三叶一心期后间苗，每盆保留1株。

1.3 样品的采集与处理

试验期间每隔5 d称重，补足土壤含水量，记录每次玉米浇水日期及浇水量。试验进行60 d后收获。收获前测定玉米株高、叶片SPAD值和光合速率，每株玉米叶片随机选择3个点作为叶片SPAD和光合速率的一次重复值。收获时分别取玉米地上部分和地下根系，留少许植物根系洗净后用于测定根系侵染率，其余地上、地下部分烘干测干重，同时轻轻抖动并收集附着在根系上的土壤用于测定土壤团聚体。

1.4 测试项目及方法

1.4.1 侵染率和菌丝密度

采用PHILLIPS和HAYMAN的方法测定侵染率，显微镜下观察侵染根段数，依据被侵染根段数占观察根段数比值计算菌根侵染率[8]。菌丝密度采用真空泵微孔滤膜抽滤-网格交叉法测定[9]。

1.4.2 球囊霉素相关土壤蛋白

球囊霉素相关土壤蛋白的提取方法参照WRIGHT的方法[10]，分为总球囊霉素（Total Glomalin，T-GRSP）和易提取球囊霉素（Easily Extractable Glomalin，EE-GRSP）进行提取。

1.4.3 菌根贡献率

Rm=（Mm-Mck）/Mck×100%

（1）

式中Rf为微生物贡献率；Mm为微生物处理植株生物量；Mck对照处理植株生物量。

1.4.4 植物生长指标

在玉米叶片随机选取6个点用 SPAD-502 Plus（Konica公司，日本）测定叶片SPAD值，取平均值。将植物地上和地下部分分别收获后，进行烘干称重，测定植物生物量。

1.4.5 植物中的磷元素含量

收集玉米地上、地下部分烘干磨碎，过孔径为0.25 mm筛，消煮后利用ICP-AES（电感耦合等离子发射光谱仪）测定[11]。

1.4.6 脲酶、磷酸酶活性

土壤脲酶测定采用改进的苯酚-次氯酸钠比色法，采用改进的TABATABAI和BREMNER的方法测定土壤磷酸酶活性[12]。

1.5数据处理与分析

使用SPSS 19.0（IBM公司，美国）软件和EXCEL 2016（Microsoft公司，美国）软件对试验数据进行统计分析。采用单因子方差分析方法对植物生长状态、菌根相关指标和土壤酶活性数据进行差异显著性分析，显著性水平为α=0.05。同一组微生物处理内数据采用双因素统计分析；考虑不同微生物处理因素，采用双因素统计进行显著性分析；采用Pearson相关性分析对土壤因子、植物因子、微生物因子之间关系进行分析。

2 结果与分析

2.1 接种微生物对植物生长的影响

2.1.1 对侵染率、菌丝密度和植株生物量的影响

菌根侵染率是反映菌根真菌侵染宿主植物根系程度的指标。接种丛枝菌根真菌处理侵染率达到80%，添加PSB处理对侵染率无显著影响（表2）。菌丝密度可体现丛枝菌根真菌与植物的共生状态，PSB处理和CK处理中未发现菌丝，AMF处理和AMF+PSB处理中菌丝密度分别为1.54 m/g和1.52 m/g，表明在黏土中解磷细菌对丛枝菌根真菌无显著影响。与CK对照相比，AMF处理、AMF+PSB处理、PSB处理地上生物量分别提高11.9%,11.4%,0.04%，地下生物量分别提高34.3%,32.8%,1.4%。单接AMF处理和联合接种AMF+PSB处理能够显著促进玉米生长发育，而接种PSB对玉米的影响并不明显，表明在黏土中单独接种解磷菌未能有效增加植物生物量。

表2 植株的侵染率、菌丝密度和生物量

2.1.2 对植物SPAD值、株高和光合影响

对黏土中的玉米接种丛枝菌根真菌，可以有效增加叶片SPAD值和净光合速率。AMF和AMF+PSB的处理中，叶片SPAD值显著高于PSB处理和CK处理，其中AMF处理SPAD值是PSB的1.16倍，是CK的1.26倍，接种解磷菌虽提高了叶片的SPAD值，但与CK处理差异不显著。净光合速率方面，AMF处理和AMF+PSB处理间差异不显著，PSB处理虽然高于CK处理，差异也不显著。AMF处理净光合速率比PSB处理提高了22.4%，较CK处理提高了27.4%。接种PSB对叶片SPAD值和净光合速率无显著影响，而接种AMF可显著影响叶片SPAD值和净光合速率，AMF+PSB处理植物叶片的反应与单接AMF处理均无显著差异。AMF处理和AMF+PSB处理可显著增加玉米的株高，较CK分别提高20.17%，20.99%。接种PSB的处理中植物株高比CK处理增加了4.6%，差异不显著，AMF+PSB处理与AMF处理株高差异不显著，但二者均显著高于PSB处理和CK处理（表3）。

2.1.3 对植株养分含量的影响

AMF处理、AMF+PSB处理有效提高了植株磷吸收量，植株地上部分、地下部分及总吸收量均显著高于PSB和CK处理，PSB处理略高于CK，但差异不显著（表4）。同时AMF处理和AMF+PSB处理玉米地上部分磷浓度高于PSB和CK处理，达到显著差异；AMF和AMF+PSB处理地下部分磷浓度高于PSB和CK处理，差异不显著。总体而言，接种AMF处理和AMF+PSB处理中微生物对磷元素吸收的贡献率分别为16.9%和18.4%，PSB处理微生物贡献率仅为0.6%，这可能是由于黏土黏粒含量多，微生物、养分迁移能力差，丛枝菌根真菌可以通过菌丝来吸收更远处的养分，而解磷细菌则难以发挥作用，分解养分也难以被植物吸收[13]。

表3 植物的SPAD值、净光合速率和株高

2.1.4 对植物根系发育的影响

接种AMF处理显著增加了根尖数、总根长、根表面积、根体积，分别为PSB处理的1.3倍、1.66倍、1.49倍和1.71倍，为CK处理的1.28倍、1.67倍、1.53倍和1.87倍（表5）。AMF和AMF+PSB处理差异不显著，2组处理显著高于PSB处理和CK处理，表明丛枝菌根促进了根系发育，这可能由于菌根真菌可在黏土中生长，促进植物根系生长发育[14]。

2.2 对土壤酶活性、球囊霉素、团聚体的影响

AMF处理和AMF+PSB处理中土壤脲酶含量显著高于CK处理和PSB处理，其中AMF处理是CK处理的1.35倍，是PSB处理的1.36倍（表6）。PSB处理、AMF处理和AMF+PSB处理磷酸酶活性均高于CK处理，但是差异不显著，表明在激活土壤磷酸酶的活性上解磷细菌和丛枝菌根真菌能够起到一定作用[15]，但在纯黏土状态下效果有限。同时由表6可知，接种丛枝菌根真菌的处理T-GRSP和EE-GRSP及水稳性团聚体都显著高于无丛枝菌根真菌的处理，表明黏土环境下丛枝菌根在土壤改良方面可发挥一定积极作用。

表4 植物磷元素浓度和吸收量

表5 不同微生物处理对植物根系发育影响

表6 接种微生物对土壤酶活性和土壤团聚体的影响

2.3 相关性分析

对不同处理下土壤微生物特性、玉米生长和土壤酶活性之间进行相关性分析表明（表7），侵染率和菌丝密度与玉米的株高、生物量、磷累积量等生长指标和脲酶、T-GRSP，EE-GRSP，土壤团聚体等土壤指标有显著相关性，与土壤磷酸酶活性没有显著相关性。玉米的生物量与丛枝菌根的微生物特性和脲酶、T-GRSP，EE-GRSP,土壤团聚体等存在显著相关关系，磷酸酶对玉米的生物量和磷的累积无显著影响。菌丝密度和侵染率显著影响玉米对磷元素的积累，同时T-GRSP和EE-GRSP也显著影响了玉米对磷的积累，这可能是由于丛枝菌根真菌分泌的GRSP具有很好的粘合能力，从而增加土壤中团聚体数量，对土壤结构进行改良，改善植物根系生长发育状况，增加菌丝吸收范围，从而扩大植物对磷元素的吸收。

表7 不同处理下微生物特性、玉米生长和土壤酶活性之间的皮尔逊相关分析

3 讨论

3.1 伴生黏土基质接种不同微生物对植物生长的影响

丛枝菌根真菌的种类、土壤基质等都会影响菌根对植物的侵染[16]。丛枝菌根真菌在宿主植物根系的定殖与植物生长发育息息相关，单接AMF处理和AMF+PSB处理玉米根系侵染率显著提高，丛枝菌根真菌与玉米形成良好的共生关系，同时由于黏土保水性，当玉米遭到水分胁迫时，丛枝菌根真菌可有效提高玉米抗逆性，对玉米生长有显著促进作用，尤其是增加玉米地下部分生物量。土壤中菌丝密度增加，大量产生的菌丝可在密度更高的黏土基质中伸展到更广的范围内吸收养分，扩大植物根系吸收范围，增加玉米生物量，提高水分和养分利用率。YOUSEFI[17]的研究发现土壤类型、磷肥的使用、微生物肥的使用会显著影响解磷菌的数量，并且丛枝菌根真菌联合解磷细菌能够显著增加小麦的生物量，与本研究的结果不同，这是由于YOUSEFI的试验中使用的基质不同，该研究中过高的黏粒含量导致土壤通透性下降，磷元素迁移能力降低，解磷菌群落难以增殖，从而导致玉米生物量的降低。解磷细菌能够促进植物对磷元素的吸收[18]，该研究中，AMF处理和AMF+PSB处理都显著增加了植物地上和地下部分的生物量，而单接PSB的处理微生物贡献率极低，这可能与黏土的黏性太强、土壤通透性太低有关；在未施加外源磷的情况下，接种丛枝菌根真菌的处理中植物对磷元素的吸收量显著高于接种解磷细菌的处理，表明在高黏粒土壤中丛枝菌根真菌能够有效促进土壤磷转化并促进植物的吸收[19]。前人研究表明，解磷菌可有效提高植株叶绿素含量及叶片光合速率[20]。而该研究中单独接种解磷菌效果不佳，与对照差异不显著，接种AMF或与AMF联合作用时则可较好发挥作用，这表明二者可以产生一定协同作用，丛枝菌根可以一定程度上减轻黏土矿物对解磷菌的抑制作用。总体来看，伴生黏土对AMF及AMF+PSB的限制作用较小，黏粒含量过高、土壤通透性差和该采矿伴生黏土中有机质含量低可能是导致解磷细菌效果较差的主要原因[21]。未来应考虑筛选耐性更强的菌种，用于该种土质或配合其他菌种使用。

3.2 接种土壤微生物对土壤指标影响

土壤酶活性能够反映土壤微生物活性和土壤生物化学反应情况[22]。谭晓燕等表明接种丛枝菌根真菌后根际土壤磷酸酶和蔗糖酶活性显著提高[23]。武志海等研究发现，解磷细菌能显著影响黑土中的磷酸酶和蔗糖酶活性[24]。刘红杰等研究发现，摩西球囊霉和微生物复合肥联合能有效增加土壤脲酶、蔗糖酶、磷酸酶的酶活性[25]。试验结果表明，AMF和AMF+PSB处理可有效促进脲酶活性，对磷酸酶活性有一定促进但差异不显著，此与前人研究不完全一致，这可能是黏土基质土壤结构特点等造成水分、温度、透气性条件等使得解磷细菌微生物活性降低，影响其代谢过程和方式，一定程度限制了微生物作用发挥[21，26]。解磷细菌对磷酸酶活性有一定促进，但是对脲酶活性没有显著影响，可能是由于接种丛枝菌根真菌和解磷菌后使植物根系周围的磷元素得到激活[16]。

丛枝菌根真菌接菌AMF处理和AMF+PSB处理球囊霉素相关土壤蛋白和水稳性蛋白含量均大大增加，这可能与丛枝菌根真菌分泌的相关土壤蛋白有关，GRSP对于土壤微粒很好的粘合能力，利用其粘合能力，土壤中的微小团聚体不断形成大团聚体、水稳性团聚体，从而使土壤结构逐渐得到改善[10]。这也表明，在伴生黏土土壤改良方面丛枝菌根作用效果总体优于解磷菌，具有更强的适应能力。