感染犬耳的杜马奈瑟菌株的分离与鉴定

赵一宁，陈新延，王丽扬，沈小兰，王彦红

(1. 扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009；2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009；3. 江苏省泰州兴化市合陈畜牧兽医站，江苏 兴化 225733)

奈瑟菌属(Neisseria)为革兰阴性菌，属于奈瑟菌科，奈瑟菌目。迄今为止，已报道的奈瑟菌约有30种[1]，虽然已有从其他哺乳动物或环境中分离出该菌的报道[2]，但该菌常被认为仅限于人类。这类微生物大多定植于黏膜表面，通常不会引起明显的病理表现，也被认为是宿主正常菌群的组成部分[3]。然而随着部分种属的进化，开始出现导致人类疾病的2种典型病原体:淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae)和脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitides)[4]。而在动物上，奈瑟菌已被确定为犬和猫正常口腔菌群的一部分，并作为继发于动物咬伤动物和人类后伤口的重要病原体[5]。在已经报道的关于动物感染奈瑟菌的病例中，并未见到耳道感染病例，本试验通过对患犬耳道分泌物进行细菌分离，得到1株细菌，经鉴定为杜马奈瑟菌(Neisseriadumasiana)，通过对其致病性、药物敏感性进行探究，为临床诊治此类细菌感染提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 病例背景 2019年9月，扬州大学动物医院接诊了1只8岁的萨摩耶犬，临床检查发现耳道有较多的分泌物，具有恶臭味，痒感明显，随后使用无菌棉签采集患犬内耳道分泌物留备病原检测。

1.2 细菌分离 在超净工作台内将无菌棉签刮取的患犬耳道分泌物接种于绵羊血平板，置于37 ℃恒温培养箱培养24 h，将分离到的菌株分别纯化至绵羊血平板和麦康凯平板。24 h后观察生长状态，同时挑取单菌落进行革兰染色，用奥林巴斯生物显微镜观察结果。

1.3 生化试验 用接种针无菌挑取纯化后的菌落接种于葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、还原硝酸盐、普通琼脂等一系列奈瑟菌属鉴定生化反应管中，37 ℃培养48 h后观察结果。

1.4 16S rDNA鉴定 通过煮沸裂解法制备分离菌株的DNA模板，按照宝生物工程(大连)有限公司16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit方法用DNA扩增仪进行PCR扩增，将扩增产物用1%琼脂糖凝胶在凝胶电泳仪进行电泳，其余扩增产物送至南京金斯瑞生物科技公司测序。测序结果在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST)搜索比对，鉴定分离菌。

1.5 小鼠人工感染试验 将6只6周龄BALB/c小鼠(购自扬州大学兽医学院比较医学中心)随机分为2个组，分别为感染组和对照组，每组3只。取分离菌株37 ℃摇菌16 h，菌液浓度参照参考文献[6]调整为5×109CFU/mL，感染组每只小鼠腹腔注射0.1 mL菌液，而对照组每只小鼠腹腔注射0.1 mL生理盐水。两组置于相同饲养环境中，每日观察小鼠状态。

1.6 药敏试验 采用纸片扩散法进行药敏试验，药敏片和判定标准来自杭州微生物试剂有限公司，先挑取分离菌涂布于血平板上，再贴上药敏片，37 ℃培养24 h后读取结果。

2 结果

2.1 细菌分离 将患犬的耳道分泌物接种于绵羊血平板37 ℃培养24 h后，长出边缘整齐、圆形隆起的不溶血灰白色菌落(图1)，该分离菌株不能在麦康凯平板上生长。革兰染色结果显示，分离菌株为阴性双球菌(图2)。

图1 分离菌培养形态

图2 分离菌镜检结果(1 000×)

2.2 生化试验 结果显示，该分离菌株可以发酵葡萄糖、麦芽糖，不能发酵蔗糖，能还原硝酸盐，普通琼脂反应为阴性，经验证该分离菌株没有运动能力。此结果与奈瑟菌生化特性基本一致。

2.3 16S rDNA鉴定 分离菌株DNA模板经PCR扩增和电泳出现了600 bp左右条带(图3)，扩增产物经测序，并在NCBI网站BLAST中比对，结果显示，与杜马奈瑟菌KY417830.1具有99.6%的同源性，确定该分离菌株为杜马奈瑟菌。

图3 16S rDNA基因的PCR扩增

2.4 小鼠人工感染试验 人工感染18 h后，对照组小鼠未见异常，感染组3只小鼠均死亡。感染组小鼠剖检变化为肝色淡，脾脏肿大，心肌表面有较多白色炎性渗出，肠腔积液(图4)。肝脏触片经美兰染色，显微镜观察可见蓝色双球菌(图5)，与分离菌镜检结果一致。

图4 小鼠人工感染试验剖检结果

图5 攻毒小鼠肝触片美兰染色结果(1 000×)

2.5 药敏试验 结果显示，分离菌株对头孢曲松钠、美洛西林、头孢噻肟、复方新诺明、氟苯尼考、庆大霉素、丁胺卡那、诺氟沙星、阿莫西林、多西环素、多黏菌素B、头孢哌酮/舒巴坦普生、左氧氟沙星、新霉素、妥布霉素、链霉素和卡那霉素共17种抗菌药敏感，仅对环丙沙星表现中介。

3 讨论

本试验从患犬的耳道分泌物中分离出1株细菌，通过对菌株的培养形态、生化特性和16S rDNA基因序列的分析，确认分离菌株为奈瑟菌属中的杜马奈瑟菌。奈瑟菌属是造成人类发病和死亡的重要原因之一[7]，在动物上的报道则较为少见，致病机制也尚不明确，根据目前的研究进展，虽然大多数奈瑟菌是无害的共生菌，但在某些特定的情况下，可能会发生由共生菌到病原体的转变，并且在组织器官中占据、生存和繁殖，导致严重的感染[8]。目前已经报道的病例大多数都与犬猫口腔中的奈瑟菌具有相关性，已知的包括宠物犬被其他犬咬伤造成的杜马奈瑟菌引起的皮肤感染[9]，人被猫咬伤后的创口感染[10]等，在这之中最常见的从动物咬伤的伤口中培养出的奈瑟菌包括犬奈瑟菌(Neisseriacanis)、动物口腔奈瑟菌(Neisseriaanimaloris)、动物咬伤奈瑟菌(Neisseriazoodegmatis)和编织奈瑟菌(Neisseriaweaveri)[2]。杜马奈瑟菌则为近几年从犬的唾液中分离鉴定出的新种[11]，除此以外，在异物造成口腔损伤、皮肤黏膜损伤的情况下，该细菌很可能会穿透黏膜的自然保护屏障，从而进入到其他组织中造成持续感染[9]。因此在有创口损伤时，需要及时进行清创消毒处理，避免动物的抓咬舔舐造成重复感染。本次致病性试验发现，分离菌株经腹腔注射人工感染小鼠可致其死亡，同时造成内脏器官肿大，引起炎症反应，虽然目前关于犬奈瑟菌感染的报道较少，但其在人和动物中表现出的危害性应该得到足够重视同时加以防范。

本试验中患病萨摩耶犬的耳道感染奈瑟菌的原因尚未可知，推测可能由于其好动的天性导致与其他犬类抓咬所致，治疗时可将患犬发病耳道内毛发剃除后，采用消毒水进行冲洗消毒，随后根据药敏试验的结果选取头孢曲松钠肌内注射3 d，同时用头孢曲松钠配制药膏外敷，通过内外兼用达到治疗的目的。