大通牦牛与枣北黄牛肺组织发育学特点比较

秦鸿楠，周 娟，李 琳，张勤文

(青海大学农牧学院，青海 西宁 810016)

低压低氧是高原环境的基本特征之一，对机体的机能和代谢均会产生影响。在低氧环境中高原动物为了维持正常的生理机能，机体需动员体内一系列的适应机制来提高机体摄入、运输和利用氧气的能力，以达到适应高原低氧环境的目的[1]。牦牛作为高原特有的大型土著动物，大多分布于海拔3 000～5 000 m 的地区，海拔3 000 m和5 000 m的大气氧含量仅为海平面氧含量的 73%和52%[2]，在这种低氧环境下牦牛经过长时间的自然选择和进化，其在解剖、生理和生化等方面都存在适应高原环境的可遗传特征[3]。比如，心肺指数高、心肺发育良好是高原牦牛及其他高原土著动物的共同特点[4]。与平原黄牛相比，高原牦牛肺泡隔较厚，肺气血屏障较薄，绝大部分是I型肺泡上皮且有间断处，肺泡上皮为非连续型上皮[5-7]。陈秋生等[8]研究发现，高原牦牛肺脏存在良好的扩张和收缩的原因是其肺泡隔、支气管管壁内有丰富且粗大的弹性纤维，并构成完整的弹性系统，同时各级支气管中杯状细胞分泌的黏液可以有效保护呼吸道的通气量。研究表明，不同品种平原动物进入高原低氧环境，随着动物肺血管平滑肌含量的增加，其对低氧的敏感程度也越高，这是形成“兽胸病”的组织学基础[9]，而大通牦牛不易形成肺动脉高压，主要是由于大通牦牛肺血管内的平滑肌含量较平原黄牛少[10]。高原牦牛在生长发育过程中，肺气血屏障平均厚度比同日龄的平原黄牛薄，此结构特点可以降低肺泡的气体交换阻力，同时有效增加气体在肺泡中的交换速率[11]。

目前，牦牛肺低氧适应的组织学研究大多集中在不同海拔成年牦牛的比较，牦牛肺发育学变化虽有少量报道，但缺乏系统性和全面性，因此，本试验选取不同发育阶段的大通牦牛和枣北黄牛作为研究对象，运用 苏木精-伊红(Hhematoxylin-eosin,H.E.)染色、Verhoeff's Van Gieson(EVG)染色方法，观测其肺组织的显微结构，探讨大通牦牛与枣北黄牛肺组织纤维结构的差异，从而分析大通牦牛肺组织适应高原低氧环境的发育特点，为进一步开展高原牦牛低氧适应的研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验动物 选取临床健康1日龄、30 日龄、180 日龄和成年(>600日龄)4 个年龄段的大通牦牛(海拔 3 700 m)作为研究对象，并选择相同日龄的枣北黄牛(海拔 100 m)作为对照。

1.2 主要仪器 脱水机(Donatello)，购自DIAPATH公司；包埋机(JB-P5)、冻台(JB-L5)，均购自武汉俊杰电子有限公司；病理切片机(RM2016)，购自上海徕卡仪器有限公司；组织摊片机(KD-P)，购自浙江金华市科迪仪器设备有限公司；烤箱(DHG-9140A)，购自上海慧泰仪器制造有限公司；正置荧光显微镜(Nikon Eclipse C1)、生物显微镜(E100)、成像系统(Nikon DS-U3)，均购自日本尼康公司；图像采集系统(Olympus DP 70)，购自奥林巴斯(中国)有限公司。

1.3 主要试剂 无水乙醇、二甲苯、酒精苏木素、三氯化铁溶液、碘液、饱和苦味酸和酸性品红，均购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.4 试验动物处理 所有试验动物均于栖息地现场屠宰，每组各取3头，屠宰后于右肺心叶、膈叶相同部位取样，4% 多聚甲醛固定，常规石蜡包埋。采用H.E.染色法观察肺泡和肺泡隔；采用EVG 染色法显示弹性纤维和胶原纤维。EVG 染色法：将酒精苏木素∶三氯化铁∶碘液按5∶2∶2 混合成 EVG 染液(提前2 d配置)，切片入 EVG 染液染 5 min，自来水冲洗；后将饱和苦味酸∶酸性品红按9∶1混合成VG染液进行复染，透明封片。

1.5 观察与测量 每张切片在Olympus DP 70图像采集系统中在200倍放大倍数下选取结构完整的5个视野进行观察并采集图片。所有图片用 Image-Pro Plus 5.1 Chinese 图像分析系统测量相关数据。

1.5.1 肺泡隔厚度(Mean alveolar septum thickness,MAST)测量 采用四点十字交叉法，按公式(1)测算线上的MAST。

(1)

式中：Tai(i=1,2,3…n)表示每个肺泡隔厚度，n表示肺泡隔的数目。

1.5.2 单位面积内肺泡数(Mean alveolar number,MAN)测量 取光学显微镜拍摄图片视野中的1个内切矩形，将此矩形面积作为1个单位面积(S)，S=138 295.53 μm2。以数上不数下，数左不数右的原则，按公式(2)计算MAN。

(2)

式中：Ani(i=1，2，3，…，n)为1个单位面积内的肺泡数，n表示测量图片数目。

1.5.3 单位面积肺实质面积/单位面积 在1个单位面积内选取任意视野测量单位面积肺实质面积，每一个标本取5个视野进行测量，取测量值的平均值，计算单位面积肺实质面积/单位面积。

1.5.4 弹性纤维占比计算 利用光学显微镜观察弹性纤维的分布情况，在1个单位面积内选取任意视野测量肺泡壁和血管的弹性纤维面积，每一个标本取5个视野值进行测量，取测量值的平均值，最后分别计算二者与肺泡总面积和血管实体总面积的比值，即为肺泡壁弹性纤维占比和血管弹性纤维占比。

1.5.5 血管中膜占比计算 每张切片找至少10个血管横切面，作经过血管中点的十字交叉线，分别测量2个血管外径(D)和4个中膜肌层厚度(t)，取其平均值，按公式(3)计算血管中膜占比。

血管中膜占比(%)=2t/D×100%

(3)

1.6 数据的统计分析 通过SPSS 23.0软件对试验数据进行独立t检验，试验数据以“平均值±标准误”来表示。以P<0.05作为差异显著性的标准。

2 结果

2.1 大通牦牛和枣北黄牛肺组织H.E.染色观察 如图1所示，大通牦牛肺泡呈圆形或半圆形，1日龄时，大通牦牛肺泡结构虽发育基本完善，但其肺泡大小和肺泡隔厚度不均匀(图1A)，而枣北黄牛单位面积内肺泡数较少，肺间质面积占比较大(图1E)；随年龄增长，30日龄时，大通牦牛肺泡隔厚度较薄，但单位面积内肺泡数、肺间质面积占比较其余3个年龄少(图1B)，枣北黄牛的单个肺泡面积较大，单位面积内肺泡数较30日龄大通牦牛少(图1F)；180日龄时，大通牦牛肺泡隔厚度增厚且分布较均匀，肺间质面积占比增加(图1C)，而枣北黄牛单位面积内肺泡数减少，单个肺泡面积增大(图1G)；成年时，大通牦牛单位面积内肺泡数较180日龄减少，肺泡隔厚度增厚(图1D)，而枣北黄牛单个肺泡面积较其他3个年龄明显增大且肺泡隔厚度变薄呈线状(图1H)。

图1 大通牦牛和枣北黄牛的肺组织结构(H.E.染色，200×)

2.2 大通牦牛和枣北黄牛肺组织中弹性纤维含量的比较 如图2所示，经EVG染色后，肺组织中弹性纤维呈黑色，胶原纤维呈红色，随着年龄的增长，大通牦牛肺组织弹性纤维含量先减少后增多，而枣北黄牛肺组织弹性纤维含量不断减少。

图2 大通牦牛和枣北黄牛肺组织弹性纤维(EVG染色，200×)

2.3 大通牦牛和枣北黄牛MAST和MAN的比较 由表1可知，大通牦牛MAST随年龄的增长而逐渐增厚；枣北黄牛的MAST出生时最厚，在成年时最薄；大通牦牛MAN随年龄的增长呈现先增加后减少的趋势；与枣北黄牛相比，180日龄时，大通牦牛MAN显著小于枣北黄牛(P<0.05)，其余3个年龄大通牦牛MAN显著大于枣北黄牛(P<0.05)。

表1 大通牦牛和枣北黄牛肺泡隔厚度和单位面积内肺泡数的比较

2.4 大通牦牛和枣北黄牛单位面积肺实质面积/单位面积和肺泡壁弹性纤维占比的比较 由表2可知，随着年龄的增长，大通牦牛单位面积肺实质面积/单位面积先减少后增加，枣北黄牛单位面积肺实质面积/单位面积则不断减小；30日龄时，大通牦牛单位面积肺实质面积/单位面积显著小于枣北黄牛(P<0.05)，180日龄和成年时，大通牦牛单位面积肺实质面积/单位面积显著大于枣北黄牛(P<0.05)。随着年龄的增长，大通牦牛肺泡壁弹性纤维占比先减少后增多再减少，在出生时其占比最高，30日龄时最低；枣北黄牛肺泡壁弹性纤维占比不断减少；1日龄和30日龄时，大通牦牛肺泡壁弹性纤维占比显著小于枣北黄牛(P<0.05)，成年时，大通牦牛肺泡壁弹性纤维占比显著大于枣北黄牛(P<0.05)。

表2 大通牦牛和枣北黄牛单位面积肺实质面积/单位面积和肺泡壁弹性纤维占比的比较

2.5 大通牦牛和枣北黄牛血管中膜占比和血管弹性纤维占比的比较 由表3可知，大通牦牛随年龄的增加其血管中膜占比先增加后减少，且在成年时含量最低，30日龄和成年时，大通牦牛血管中膜占比显著大于枣北黄牛(P<0.05)；大通牦牛血管弹性纤维占比随年龄的增长呈现先减少后增加再减少的趋势，且其含量在180日时龄最高，30日龄时最低，而枣北黄牛血管弹性纤维占比随着年龄的增长呈现先增加后减少的趋势，且在30日龄时含量最高，成年时含量最低，30日龄时大通牦牛血管弹性纤维占比显著小于枣北黄牛(P<0.05)，其余3个年龄大通牦牛血管弹性纤维占比显著大于枣北黄牛(P<0.05)。

表3 大通牦牛与枣北黄牛血管中膜占比和血管弹性纤维占比的比较

3 讨论

机体对高原低氧环境的适应，主要围绕氧气的摄入、运输和细胞的利用3个环节展开。而肺作为气体交换的器官，其组织结构和功能在氧气的摄入过程中发挥重要的作用，牦牛肺组织在长期进化过程中形成的结构特点为保证其在高原低氧环境中有充足的氧气摄入提供了重要的组织学保障。

肺泡隔由肺泡壁毛细血管和其周围的肺气血屏障构成，本试验表明大通牦牛肺泡隔厚度随着年龄增长逐渐增厚，结合本课题组前期研究[9-11]得到的大通牦牛较平原黄牛有较薄的肺气血屏障的结果，牦牛肺组织有较多的肺泡壁毛细血管是导致肺泡隔厚度增加的主要原因，较薄的肺气血屏障可使肺气体交换过程中阻力减小，较多的肺泡壁毛细血管可增加肺气体交换速率，而本试验结果中，随年龄增长，180日龄时肺泡壁弹性纤维增加也是导致肺泡隔厚度增加的另一个原因，弹性纤维的数量增加，可增加肺泡的弹性回缩力，为肺的良好换气提供重要保障，由于成年时大通牦牛逐渐适应了低氧环境，因此大通牦牛的肺泡壁弹性纤维占比减少。陈秋生等[8]在成年牦牛的研究中也发现，牦牛肺泡隔、支气管管壁内都存在丰富且粗大的弹性纤维，构成完整的弹性系统。其他学者在藏羊中研究也发现，藏羊肺泡隔厚度显著厚于小尾寒羊，藏羊肺泡隔内毛细血管较小尾寒羊丰富，多呈开放状态且管径较粗，肺泡隔内弹性纤维粗大且数量多[12-14]，也证明了高原土著动物肺组织具有肺泡隔较厚、毛细血管较多和弹性纤维较多的特点。肺泡隔、支气管管壁内都存在有丰富的弹性纤维并构成完整的弹性系统，可以使肺脏处于良好的扩张和收缩状态，保证肺内气体有效的排出。

本试验结果显示，在大通牦牛发育过程中，30日龄是一个相对特殊的阶段，主要表现为此阶段有较高的单位面积内肺泡数、较低的肺泡壁弹性纤维和血管弹性纤维占比的特点，此结果与魏青[5]的研究结果一致，结合本课题组前期研究[5-6]，大通牦牛在30日龄肺泡进入快速发育阶段，其单位面积内肺泡数急剧增多，这在肺切片观察中得到证实。本试验中，随年龄增长，肺泡壁弹性纤维和血管弹性纤维占比的增加，导致肺实质面积占比增加和单位面积内肺泡数逐渐减少。

已有研究认为，随着肺血管平滑肌含量的增加，动物对于低氧的敏感程度也逐渐增加[15]。在本试验中，大通牦牛血管中膜占比较枣北黄牛丰富，且差异显著(P<0.05)，主要原因可能是大通牦牛肺血管内平滑肌含量有利于动脉的射血及血液循环，更好的维持牦牛的肺血液循环量。这与靳新花等[16]报道的研究结果一致，其认为成年牦牛肺血管内平滑肌含量丰富。

综上所述，与枣北黄牛相比，大通牦牛随年龄的增长，其肺泡隔厚度增厚、肺泡壁弹性纤维占比和血管弹性纤维占比先降低后升高再降低，单位面积内肺泡数和血管中膜占比先增加后减少。这些肺显微结构的特点是大通牦牛适应高原低压低氧环境的组织学基础。