基于近红外光谱分析技术的干姜质量快速评价研究
2022-12-08张振宇常相伟余代鑫邹冬倩周桂生段金廒
张振宇,常相伟,严 辉*,余代鑫,邹冬倩,周桂生,郭 盛,段金廒*
基于近红外光谱分析技术的干姜质量快速评价研究
张振宇1,常相伟2,严 辉1*,余代鑫1,邹冬倩1,周桂生1,郭 盛1,段金廒1*
1. 南京中医药大学,中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心/江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/江苏省方剂高技术研究重点实验室,江苏 南京 210023 2. 安徽中医药大学药学院,安徽 合肥 230012
采用近红外光谱分析技术建立干姜中多指标成分含量快速预测方法,对不同产地干姜进行快速无损的质量评价,提高干姜的质量控制水平。建立同时测定干姜中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚等4个主要活性成分的超高效液相色谱方法,并以其测定值为参比;采集不同产地干姜的近红外光谱,比较筛选出最优的光谱预处理方法,采用联合区间偏最小二乘法优选出最佳光谱区间,构建干姜各指标成分的最优偏最小二乘回归(partial least squares regression,PLSR)定量模型。建立的干姜中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚最佳PLSR定量模型的校正决定系数(2C)分别为0.973、0.980、0.979和0.938,预测决定系数(2P)分别为0.926、0.920、0.883和0.781,4个定量模型的预测相对分析误差(residual predictive deviation, RPD)均大于2,表明建立的近红外光谱定量模型的预测值与测定值具有良好的线性关系,模型预测效果良好。所建立近红外光谱定量模型,可以实现干姜中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚等4个主要活性成分含量的快速预测,方法简便快捷,结果准确可靠,可为干姜质量的快速评价提供依据。
干姜;近红外光谱;6-姜酚;8-姜酚;10-姜酚;6-姜烯酚;定量模型
干姜为姜科植物姜Rosc.的干燥根茎,始载于《神农本草经》,被列为中品,味辛、温,具有温中散寒、回阳通脉、温肺化饮等功效[1],临床上常用于治疗脘腹冷痛、呕吐泄泻、肢冷脉微、寒饮喘咳等症[2]。干姜富含姜辣素类、挥发油和二苯基庚烷类等多类型化学成分[3-4],其中姜辣素是干姜主要的活性成分,主要包括6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚和8-姜烯酚等酚类成分[3],以6-姜酚的含量最高。现代研究表明,姜辣素类成分具有抗炎抗氧化、抗肿瘤、保肝利胆、神经保护和改善认知功能等作用[3,5-6],为干姜发挥药效的主要物质基础[7-9]。
目前,大多数研究多采用HPLC[10]、LC-MS[11]、GC[12]、GC-MS[13-14]等方法对姜中主要活性成分的含量进行测定。HPLC、UPLC、LC-MS等现代常用的分析方法检测过程复杂繁琐,且成本较高,不适宜于大批量以及日常的快速检测。近年来,近红外光谱分析技术(near infrared spectroscopy,NIRs)以其高效、便捷,样品处理简单、无损检测、分析快速、无污染等特点[15],成为目前发展最快和最具有应用前景的过程分析技术之一,已广泛应用于中药的成分含量预测[16-18]、产地判别[19-20]、真伪鉴别[21-22]及中药制剂生产过程的在线监测[23-24]等方面。但是利用近红外光谱分析技术同时对不同产地干姜中多种活性成分含量进行快速预测的研究还未见报道。
本研究以6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚为指标成分,建立同时测定不同产地干姜中该4个指标成分含量的UPLC方法,应用NIRs分析技术结合偏最小二乘回归法分别建立各成分的定量分析模型,实现对不同产地干姜中4个指标成分的快速、无损测定,为干姜药材质量的快速评价提供依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器
Waters Acquity超高液相色谱仪-光电二极管阵列检测器(UPLC-PDA,美国Waters公司);AntarisTMII型傅里叶变换近红外光谱仪,InGaAs检测器,配备漫反射积分球附件、石英样品杯、Result软件和TQ Analyst 9.0软件(美国Thermo Fisher Scientific公司);FW80型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司);KH-500DV型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司);EPED型超纯水系统(南京易普易达科技发展有限公司);Sartorius BT125D型电子分析天平(德国塞利多斯科学仪器有限公司)。
1.2 材料
新鲜生姜样品采收自2020年10~12月,样品信息见表1。所有样品经由南京中医药大学严辉副教授鉴定姜科姜属植物姜Rosc.的根茎。样品收集,统一洗净后于60 ℃烘干,粉碎后过3号筛,干燥贮藏备用。
对照品6-姜酚(批号AF8111995)、8-姜酚(批号AF20070715)、6-姜烯酚(批号AF20050113)、10-姜酚(批号AF20070716)均购自成都埃法生物科技有限公司,以上对照品质量分数均≥98%。实验用水为实验室超纯水系统自制纯水与超纯水;甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯)均购自美国默克公司,甲醇(分析纯,批号20190116)购自国药集团化学试剂有限公司。
表1 干姜药材样品信息
2 方法与结果
2.1 UPLC法测定干姜中4种成分的含量
2.1.1 供试品溶液的制备 精密称取本品粉末(过3号筛)约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加入75%甲醇20 mL,称定质量,超声处理50 min,用75%甲醇补足减失的质量,摇匀,提取液经13 000 rpm条件下离心10 min,上清液过0.22 μm的滤膜,取续滤液,即得供试品溶液。
2.1.2 对照品溶液的制备 称取6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚对照品适量,精密称定,加75%甲醇溶解并稀释,制成质量浓度分别为0.612、0.176、0.350、0.057 mg/mL的混合对照品溶液。将混合对照品溶液逐级稀释成系列质量浓度,用于线性关系考察,不同质量浓度的混合对照品溶液经0.22 μm微孔滤膜滤过,4 ℃保存,备用。
2.1.3 液相色谱条件 采用Waters ACQUITYTMUPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)色谱柱,体积流量0.4 mL/min,柱温30 ℃,进样量2 μL,检测波长280 nm。流动相为0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)系统,梯度洗脱:0~8 min,5%~40% B;8~12 min,40% B;12~14 min,40%~56% B;14~19 min,56% B;19~25 min,56%~90% B;25~26 min,90% B。干姜药材和混合对照品液相色谱图如图1所示。
1-6-姜酚 2-8-姜酚 3-6-姜烯酚 4-10-姜酚
2.1.4 线性关系考察 依次精密吸取各混合对照品溶液2 μL,注入液相色谱仪中,测定峰面积,以对照品溶液质量浓度为横坐标(),各色谱峰峰面积的积分值为纵坐标(),绘制标准曲线,计算标准曲线回归方程及相关系数()。4种成分的线性回归方程和线性范围见表2。
表2 线性关系考察
2.1.5 精密度试验 取同一对照品溶液,连续进样6次,进样量2 µL,测定6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚和10-姜酚的峰面积,计算得RSD值(=6)分别为0.18%、0.54%、0.92%和0.20%,表明仪器精密度良好。
2.1.6 重复性试验 按照“2.1.1”项下方法平行制备6份供试品溶液,按照“2.1.3”项下色谱条件测定峰面积,结果6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚和10-姜酚的RSD值(=6)分别为0.79%、1.81%、1.32%和0.84%,表明该方法的重复性良好。
2.1.7 稳定性试验 取同一供试品溶液,分别于配制后0、2、4、8、12、24 h进行测定,进样量2 µL,测定6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚和10-姜酚的峰面积,其RSD(=6)分别为0.33%、1.46%、0.65%和0.58%,表明供试品溶液的稳定性良好。
2.1.8 加样回收率试验 精密称定已测定成分含量的干姜样品6份,每份0.1 g,加入各对照品溶液适量,按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液,按“2.1.3”项下色谱条件进样,测定各成分含量,计算各成分的回收率。结果显示,6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚和10-姜酚的平均回收率分别为101.53%、102.25%、99.49%和104.01%;RSD分别为1.11%、2.07%、1.85%和2.87%,结果表明方法准确度良好。
2.1.9 样品测定 取各干姜样品,按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液,按“2.1.3”项下色谱条件进样,测定峰面积,按标准曲线计算各样品中各成分的含量。
2.2 近红外光谱的获取
称取过60目筛的样品粉末于样品杯中,在室温条件下扫描获得原始光谱。仪器参数设置如下:扫描范围为10 000~4000 cm−1、分辨率为8 cm−1、累计扫描次数32次。为了提高收集的光谱数据的准确性,每个样品的光谱扫描3次,然后将平均光谱用于后续分析。55批样品的原始近红外光谱图见图2。
图2 不同产地干姜药材的原始近红外光谱
2.3 干姜中4种有效成分的定量模型的建立
偏最小二乘回归法(partial least squares regression,PLSR)是一种可用于构建近红外光谱数据校准模型的强大统计技术,可以在数据集降维的基础上探索自变量和因变量之间的关系[25],此外课题组前期研究表明PLSR对于光谱建模具有出色的预测和推断能力[26-28],本研究中采用PLSR建立波长为10 000~4000 cm−1的干姜近红外光谱定量校正模型。模型拟合效果以校正决定系数2C(coefficients of determination for calibration)、7折交叉验证法的交叉验证均方根误差(root mean squares error of cross-validation,RMSECV)、校正均方根误差(root mean square error of estimation,RMSEE)、预测决定系数(coefficients of determination for prediction,R2p)和预测均方根误差(root mean square error of prediction,RMSEP)为评价指标。相关系数越大,均方根误差越小,所对应的模型拟合效果越好。为了使预测准确度标准化,并消除样本集不同而造成的影响,预测相对分析误差[residual predictive deviation,RPD=SD/RMSEP] 作为综合指标被用于评价模型的预测能力,RPD值越大,所对应的校正模型的预测性能越好[26]。
2.3.1 近红外光谱处理 为了降低样本分类带来的人为误差,将干姜样本按2:1随机分为校正集(calibration set)和预测集(prediction set),各有效成分的含量分布见表3。55个干姜样本中37样本组成校正集,18个样本组成验证集。由于光散射、光路的长度、样品粉末的粒度等因素的影响,原始光谱包含着许多化学成分的信息的同时也包含着许多与供试样品性质无关的背景和系统噪音[29-30]。因此采取多种光谱预处理方法去除不代表实际目标化学成分的无关变量。采用标准正态变量变换(standard normal variate transformation,SNV)、多元散射校正(multiplicative scatter correction,MSC)、一阶导数(first derivative,1D)、二阶导数(second derivative,2D)、标准正态变量变换结合一阶导数(SNV+1D)、标准正态变量变换结合二阶导数(SNV+2D)、多元散射校正结合一阶导数(MSC+1D)和多元散射校正结合二阶导数(MSC+2D)等8种预处理方法对光谱进行预处理。其中1D和2D均使用Savitzky-Golay算法的11点平滑。光谱数据的预处理及建模分析在TQ Analyst 9.0中实现,图形的绘制在Origin 2018中实现。
比较了8种不同的预处理(MSC、SNV、1D、2D、MSC+1D、MSC+2D、SNV+1D和SNV+2D)对于PLSR模型构建的影响,结果见表4。对于6-姜酚,最佳的预处理方法为MSC+1D,与文献报道的研究相符[31],预处理后最佳PLSR定量模型的因子数为6,2C和2P分别为0.976和0.903,RPD为2.779;8-姜酚的最佳预处理方法为SNV+2D,预处理后最佳PLSR定量模型的因子数为4,2C和2P分别为0.958和0.903,RPD为2.917;10-姜酚的最佳预处理方法为2D,预处理后最佳PLSR定量模型的因子数为8,2C和2P分别为0.996和0.881,RPD为2.662;6-姜烯酚的最佳预处理方法为2D,预处理后最佳PLSR定量模型的因子数为6,2C和2P分别为0.957和0.657,RPD为2.040。在构建的4种成分的定量模型中,6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚的2C均大于0.95,2P均大于0.88,模型构建效果良好;而6-姜烯酚的2P仅0.657,模型效果较差。经过筛选后的最佳预处理方法获得的PLSR定量模型其RPD值均大于不经过预处理的原始光谱的定量模型,说明经过预处理后的近红外定量模型效果得到了明显的改善。
2.3.2 光谱区间优选 为了减少不相关变量造成的冗余性和共线性,并进一步提高校准模型的预测能力和稳定性,基于筛选出的最佳光谱预处理方法,使用联合区间偏最小二乘法(synergy interval-PLS,Si-PLS)从全波长中筛选特征光谱区间组合,特征光谱区间的筛选在MATLAB R2017a中实现。Si-PLS的主要优点是使用图形显示以选择更好的子间隔并进行比较光谱波段模型与全光谱模型的预测性能[32]。
表3 干姜样品中4种成分的含量分布
表4 不同光谱预处理方法对模型的影响
本研究中,首先将预处理后的全光谱区域(经SG算法11点平滑后为9 981.74~4 018.92 cm−1)分成20个等距区间,并将每个光谱区间中的2~4个子区间进行组合,以评价其联合效果[26]。所有组合均通过交叉验证确定,RMSEP最小的组合被视为最佳组合,根据筛选出的最佳光谱区间构建最佳PLSR定量模型,筛选出的特征区间范围和定量校正模型如图3、4所示。4种成分的PLSR模型参数如表5所示,6-姜酚的最佳光谱联合区间为[5,17,20],对应的波长范围为8 789.95~8 492.97 cm−1、5 206.86~4 913.73 cm−1和4 312.05~4 018.92 cm−1(图3-A);8-姜酚的最佳光谱联合区间为[15,18,20],对应的波长范围为5 804.68~5 511.56 cm−1、4 909.88~4 616.75 cm−1和4 312.05~4 018.92 cm−1(图3-B);10-姜酚的最佳光谱联合区间为[13,20],对应的波长范围为6 402.51~6 105.53 cm−1和4 312.05~4 018.92 cm−1(图3-C);6-姜烯酚的最佳光谱联合区间[17、19],对应的波长范围为5 206.86~4 913.73 cm−1和4 612.89~4 315.91 cm−1(图3-D)。6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚这3种姜酚类成分选定的光谱区间的共同特征是都包括4 312.05~4 018.92 cm−1的波长范围,提示其可能是确定干姜中姜酚类成分含量的重要吸收波长范围。在相同的光谱预处理方法下,使用选定的最佳光谱区间优化后的PLSR模型具有更高的2P和RPD值,以及更低的RMSEP,其中6-姜烯酚定量模型的2P由原来的0.657提升至0.781,得到了较大的改善,表明相比于全波长构建的定量模型,这些优化后的模型效果更好更可靠,且最终优化模型的RPD值均大于2,表明所建立的定量模型具有良好的预测精度。
图3 Si-PLS筛选的最佳波长区间
图4 UPLC检测值与近红外模型预测值相关性图
表5 基于选定光谱区间组合和预处理方法的PLSR模型效果
3 讨论
本研究采用UPLC对不同产地干姜药材中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚的含量进行了测定,通过比较8种不同的预处理方法筛选出最佳的光谱预处理方法,并采用Si-PLS优选出最佳的光谱区间组合,建立了6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚最佳的PLSR定量模型。6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的2P分别为0.926、0.920、0.883,表明最终优化的PLSR模型具有良好的预测性能,预测结果与真实值接近,虽然6-姜烯酚的模型预测效果稍差,但也达到了0.781。表明近红外光谱结合PLSR法能够对干姜中4种姜辣素类成分进行很好的预测,是一种能够快速对干姜进行快速质量评价的检测方法。
干姜为传统药食两用药材,现行《中国药典》2020年版规定的干姜指标性成分仅有6-姜酚1个成分,无法全面客观的评价干姜的品质,且常规的薄层色谱法、液相色谱法既费时又费力。与传统繁琐、耗时的化学方法相比,近红外光谱技术具有样品预处理简单、快速无损、结果准确可靠等优点,本研究建立的多种成分的干姜近红外含量预测模型,弥补了干姜药材质量控制指标较为单一的情况,可作为进一步对干姜药材质量评估的基础,并为农产品、医药和食品的质量分析提供有益参考。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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Rapid quality evaluation ofbased on near-infrared spectroscopy
ZHANG Zhen-yu1, CHANG Xiang-wei2, YAN Hui1, YU Dai-xin1, ZOU Dong-qian1, ZHOU Gui-sheng1, GUO Sheng1, DUAN Jin-ao1
1. National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine, and Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230012, China
To establish a rapid qualitative method for evaluating the content of multi-index components quickly and non-destructively by using near infrared spectroscopy (NIRs), and improve the quality control level offrom different geographical origins.An ultra performance liquid chromatography (UPLC) method was established to determine the contents of 6-gingerol, 8-gingerol, 10-gingerol and 6-shogaol in, which were adopted as the reference value. The NIRs of the samples from different geographical origins were collected. The different spectral pretreatment methods were compared and the best one was selected. Synergy interval-PLS was used to screen the characteristic spectral interval to obtain the best partial least squares regression (PLSR) model of each index component of.The coefficient of determination for calibration (2C) for the best PLSR models established for the quantitative determination of 6-gingerol, 8-gingerol, 10-gingerol, and 6-shogaol inwas 0.973, 0.980, 0.979, and 0.938, respectively, while the coefficient of determination for prediction (2P) was 0.926, 0.920, 0.883, and 0.781, respectively. The values of residual predictive deviation (RPD) of the four final optimized PLSR models were greater than 2. The results suggested that the predicted values of NIR models and the measured values showed a good linear relation, indicating a great prediction ability of the models.The established NIRs quantitative model could realize the rapid determination of the contents of 6-gingerol, 8-gingerol, 10-gingerol, and 6-gingerol in. This method is simple and fast, and the results are accurate and reliable, which can serve as a reference for rapid quality evaluation of
; near infrared spectroscopy; 6-gingerol; 8-gingerol; 10-gingerol; 6-shogaol; quantitative model
R286
A
0253 - 2670(2022)23 - 7516 - 08
10.7501/j.issn.0253-2670.2022.23.023
2022-07-12
国家重点研发计划项目(2020YFC1712700);财政部和农业农村部:国家现代农业产业技术体系资助(CARS-21);江苏省“333高层次人才培养工程”;江苏省高校“青蓝工程”
张振宇(1997—),硕士研究生,从事中药资源与鉴定研究。Tel: 15251766992 E-mail: 15251766992@163.com
通信作者:严 辉,教授,研究方向为中药资源与资源化学。Tel: (025)85811917 E-mail: yanhui@njucm.edu.cn
段金廒,教授,研究方向为中药资源化学与资源循环利用。Tel: (025)85811291 E-mail: dja@njucm.edu.cn
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