LC/MS-MS法测定水产品中硝基呋喃类代谢物（AOZ、AHD、SEM）方法研究

吴 刚

（宁夏回族自治区食品质量监督检验二站，宁夏银川 750001）

硝基呋喃类药物是一类人工合成的抗生素类药物，对细菌和病原菌等具有灭杀作用。其主要包含呋喃唑酮（FZD）、呋喃妥因（NFT）、呋喃西林（NFZ）等[1]。随着世界贸易的发展和人口数量的增多，人们对水产品的需求逐渐增加，硝基呋喃类药物作为一种抗菌药物被广泛用于水产品养殖中。水产养殖户在利益的驱使下，非法使用违禁药品，造成水产品存在安全隐患，危害人体健康。目前国内外均禁止使用，要求在动物性食品中不得检出。但因为其在治疗水产养殖动物细菌性尤其是胃肠道等细菌性疾病方面快速有效，仍有渔民使用。本研究以水产品为检测对象，优化水产品中硝基呋喃类代谢物残留的提取净化方法，建立高效液相色谱-串联质谱法检测水产品中硝基呋喃类代谢物（AOZ、AHD、SEM）分析方法，为水产品的质量监控提供参考[2]。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

本实验所用主要仪器设备见表1。

表1 仪器设备表

1.2 试剂材料

本实验所用主要试剂见表2。

表2 实验试剂表

1.3 溶液的配制

储备液的配制见表3。

表3 储备液的配制表

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件选择

色谱条件为C18色谱柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm），柱温35 ℃，流动相流速0.35 mL·min-1，流动相（A：乙酸铵溶液，B：甲醇），梯度洗脱条件见表4。

表4 梯度洗脱条件表

1.4.2 质谱条件选择

本实验的质谱条件见表5。

表5 质谱条件表

1.5 样品前处理

1.5.1 提取

取水产品可食部分，切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小块，充分匀浆备用，加入0.05 mL混合内标工作溶液，称取样品2.0 g（精确至0.01 g）于50 mL塑料离心管中，涡旋混合30 s，加入5 mL盐酸溶液（0.1 mol·L-1）和 15 mL 2- 硝基苯甲醛溶液（2- 硝基苯甲醛，用二甲亚砜溶解并稀释至10 mL，混匀，现用现配），混匀涡旋振荡30 s，置于恒温水浴锅中37 ℃避光恒温12 h。

1.5.2 净化

取出离心管冷却至室温，用磷酸氢二钾溶液调pH值至7.0～7.5，加乙酸乙酯8 mL，涡旋振荡30 s，6 000 r·min-1离心5 min，取上清液至10 mL玻璃离心管，40 ℃氮气吹干。加5%甲醇溶液1.0 mL溶解残留物，再将溶液转移至1.5 mL离心管中，以4 ℃ 10 000 r·min-1的转速离心 10 min，取清液过0.22 μm滤膜，供液相色谱-串联质谱分析。

1.6 含量计算公式

水产品中的呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因的含量按式（1）计算。

式中：W1为样品含量，mg·kg-1；C1为标准曲线得到的样品浓度，ng·mL-1；m为样品质量，g；V为待测液的体积，mL，D为样品稀释倍数。

1.7 定性、定量测定

用保留时间及碎片离子二级质谱进行定性[3]，用产生的模拟数据信号响应体现数值，用外标法或内标法进行化合物目标值进行定量[4]；得出定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差范围，详见表6。

表6 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差表

1.8 方法学验证

称取水产样品5.00 g（精确至0.001 g），加入呋喃唑酮、呋喃西林和呋喃妥因标准应用液，分别进行精密度、稳定性、加标回收率和检出限与定量限试验[5]。

2 结果与分析

2.1 方法相关性条件的确定

2.1.1 色谱图和保留时间

通过质谱相应参数，对AOZ、SEM、AHD浓度为200 ng·mL-1的标准溶液进行进针，色谱图见图 1～ 3。

图1 AOZ色谱图

图2 AHD色谱图

图3 SEM色谱图

2.1.2 质谱参数的确定

通过仪器调谐参数明细及查阅相关质谱技术文献，确定质谱调谐最佳优化参数。流动相：乙酸铵溶液（0.01 mol·L-1）-甲醇（体积比1∶1），流速为0.20 mL·min-1，调谐液浓度为 200 ～ 500 ng·mL-1，色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C1（81.7 μm，2.1 mm×100 mm），系统采集方法为ESI正离子源，MS质谱模式（多反应离子监测），通过仪器Maslyne Calculation软件计算得出其（AOZ、AHD、SEM）各自相关的母离子分别为236、249、209，其他优化条件见表7。

由表7可得出AOZ、AHD、SEM最优质谱条件：毛细管电压为3.0 kV，离子源温度为150 ℃，锥孔气流速为1 000 L·hr-1，脱溶剂气温度为500 ℃，柱温为35 ℃，其响应值为6.0e5。

表7 AOZ、AHD、SEM离子优化条件表

将AOZ、SEM、AHD的 混 合 标 准 溶 液200 ng·mL-1进针一次，由图1～3得到其保留时间为5.75 min、5.84 min、5.75 min，最终得出AOZ、SEM、AHD色谱、质谱条件如表8所示。

表8 AOZ、AHD、SEM色谱、质谱条件表

2.1.3 标准曲线的绘制

分别准确移取AOZ、AHD、SEM标准储备溶液（1 000 μg·mL-1）0.50 mL、0.20 mL、0.10 mL、0.05 mL和 0.01 mL 于10 mL容量瓶中，配制成 50 μg·mL-1、20 μg·mL-1、10 μg·mL-1、5 μg·mL-1和 1 μg·mL-1的混标工作液，按上述确定的色谱条件进行测定。以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得出线性方程的相关系数和范围（见表9）。

由表9可知，AOZ、AHD、SEM的相关系数均大于0.995，在其线性范围内其浓度与峰面积呈良好的线性关系，满足试验分析要求。

表9 AOZ等标准曲线的线性方程、相关系数和线性范围表

2.2 方法学验证

2.2.1 精密度试验

称取水产品样品5.00 g（精确至0.001 g）共3份，分别加入1 mL的50 ng·mL-1呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因标准应用液，连续进样6次，测定结果见表10。

由表10可知，在同一质谱仪测定值的RSD均小于5%，说明试验精密度良好。

表10 精密度试验结果表（单位：%）

2.2.2 加标回收率试验

分别称取水产品样品5.00 g（精确至0.001 g）两组，编号记为A、B，对两组样品分别进行低水平（LOQ）和高水平（4LOQ）添加，选用1.5方法进行样品前处理，再进行加标回收率测定结果，如表11所示。

表11 不同加标浓度的验证数据表

不同加标水平下，AOZ、AHD、SEM的加标回收率均符合GB 31656.13—2021的要求。

2.2.3 稳定性试验

称取水产品样品5.00 g（精确至0.001 g）3份，分别加入2.00 μg·kg-1的呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因标准混合溶液，静置30 min、60 min、90 min和120 min后上机测定，分别测定60 min内（30 min及 60 min）精密度 RSD% 及120 min内（30 min、60 min、90 min和120 min）精密度RSD%。

由表12可得，呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因加标样品均应在0～4 ℃避光保存，60 min内测定值稳定。

表12 样品中添加标准混合溶液稳定性试验表

2.2.4 检出限与定量限试验

检出限与定量限试验结果见表13。

表13 检出限与定量限结果表

2.3 样品含量测定

选取市场中两种不同水产品，编号为A、B，每个样品称取5.00 g（精确至0.001 g），按最终优化后的前处理方法对样品进行处理，上机测定。

由表14可知，不同水产品中的呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因符合GB 31656.13—2021标准的规定。

表14 样品测定结果表（单位：μg·kg-1）

3 结论

本试验建立了检测水产品中硝基呋喃类代谢物的方法，结论如下。

（1）质谱条件的确定。电喷雾电压为3.0 kv，离子源温度为150 ℃，脱溶剂气温度为500 ℃、脱溶剂气流速为1 000 L·Hr-1，柱温为30 ℃，选用ACQUITY UPLC BEH C18（ 1.7 μm，2.1 mm×100 mm）色谱柱，得出良好峰型的色谱图。以乙酸胺和甲醇溶液进行梯度洗脱。采用正模式ESI源，定量检测选用多重反应模式。该方法具有良好的稳定性、操作简单方便、快速且灵敏高等特点。

（2）前处理条件的确定。选用涡旋和超声相结合的提取方式，0.1%甲酸-乙腈溶液为提取溶剂，CNW POLY-SERY MCX为固相萃取柱。

（3）呋喃唑酮、呋喃西林和呋喃妥因等标准曲线的线性范围分别为10～200 ng·mL-（1R2=0.996 9）、10 ～ 200 ng·mL-1（R2=0.999 2）、10 ～ 200 ng·mL-1（R2=0.999 0），有良好线性关系。方法学验证表明该方法准确率高、精密度良好。

综上，本次实验将质谱法作为检测方法，具有精密度高、定性准确、定量精度高等特点。检测指标均符合国家标准要求，适合于水产品中硝基呋喃类代谢物残留检测。