克罗诺杆菌属快速检测技术的研究进展

◎ 林 杰

（厦门市产品质量监督检验院，福建 厦门 361004）

克罗诺杆菌是一种危险性极高的致病菌。有研究表明，婴幼儿奶粉、奶酪、腌肉、饮用水和蔬菜等多种日常食品中均可能检测出此种致病菌[1]。在一些新生儿克罗诺杆菌感染事件的调查结果中，这些受感染的新生儿都是食用了婴幼儿奶粉后才出现了相关症状，经检测确定为克罗诺杆菌感染。近年来，随着一系列与此种病菌相关的奶粉召回以及其他重大事件的爆发，克罗诺杆菌污染问题已经受到了全世界的广泛关注。基于此，探讨如何快速完成对食品中是否含有克罗诺杆菌检测的必要性。

1 克罗诺杆菌

克罗诺杆菌原名阪崎肠杆菌，在人和动物的肠道内生活，属于兼性厌氧革兰氏阴性杆菌，隶属于肠杆菌科。克罗诺杆菌是一种致病剂量较低的食源性致病菌，广泛存在于婴幼儿奶粉、肉类、饮用水和蔬菜中。寄生在人和动物的肠道之后（是一种有周生鞭毛，能运动的无芽孢杆菌），可引起菌血症、脑膜炎、坏死性小肠结肠炎等疾病。近年来发生的多起克罗诺杆菌感染事件表明，婴幼儿是该菌感染的高危人群，一旦引发相关疾病，致死率最高可达80%。目前，已经探明的克罗诺杆菌共有7个菌种，分别为阪崎克罗诺杆菌、丙二酸盐克罗诺杆菌、苏黎世克罗诺杆菌、莫金斯克罗诺杆菌、康帝蒙提克罗诺杆菌、尤尼沃斯克罗诺杆菌和都柏林克罗诺杆菌（可进一步分为都柏林亚种、奶粉亚种、洛桑亚种）。

目前，世界各国已经从分类、分型、检测、生化特性、致病性和污染源等方面对克罗诺杆菌进行研究，结果表明，与其他食源性致病菌相比，该菌对绝大多数人都不存在致病性，即使摄入人体内，也能够在肠道内与其他菌群“和谐相处”。但对包含婴幼儿在内的一些特定人群，克罗诺杆菌的致病率和致死率却较高，而目前学界尚未探明克罗诺杆菌因何原因致特定人群感染严重疾病。基于此，只能采取“一刀切”政策，即对各类可能与人类、动物（主要是家养宠物、养殖牲畜、家禽等）密切接触的物品进行检测时，将克罗诺杆菌作为一项重点检测内容。

2 基于分子生物学的快速检测技术

2.1 聚合酶链式反应技术

聚合酶链式反应技术英文全称Polymerase Chain Reaction，简称PCR，可被视为“生物体外特殊DNA复制”。此种链式反应的过程如下。①将一种物质的DNA自生物体内取出，放置于95 ℃的高温环境下，此时，DNA会“变性”成单链状态。②降低环境温度（一般控制在60 ℃左右）后，单链与引物的碱基会自动完成“互补配对”。③再次升高环境温度（此时无需升高至步骤①的程度，只需控制在72 ℃左右即可，而该温度是最适合DNA聚合酶反应的温度），此时，DNA聚合酶会沿着磷酸到五碳糖的方向完成互补链的合成。总体而言，PCR技术可视为“模拟DNA天然复制的过程”，特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，经过上述3个阶段后，会合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸3过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4 min，2～3 h就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍[2]。由此可见，使用PCR技术监测克罗诺杆菌时，即使按照最传统、最原始的PCR合成方法，只需数个小时便可确定被检测物品内是否含有克罗诺杆菌。

2.2 实时荧光定量聚合酶链式反应技术

此种技术的本质仍然是PCR技术，是指在DNA扩增反应的过程中，使用荧光化学物质，对PCR循环后产物的总量进行测量，并通过内参法或外参法，对检测样品中特定的DNA序列进行定量分析。具体而言，在PCR扩增的指数时期，检测模板的CT值（循环阈值）以及其拷贝数之间存在一种线性关系，而此种关系可以作为定量的依据。采用荧光定量PCR技术检测克罗诺杆菌的具体方法分为2种。①SYBRGreen I法。在PCR反应过程中，加入过量的SYBR荧光染料，该染料具有特异性，掺入DNA的双链后，能够发射荧光信号，而没有掺入链中的染料分子不会发射荧光信号。因此，SYBR荧光信号增加速度与PCR产物增加速度完全一致，只需绘制出SYBR定量PCR扩增荧光曲线图，并与克罗诺杆菌DNA天然复制的曲线图进行比对，即可判断检测样本中是否含有克罗诺杆菌。②TaqMan探针法。此种方法的本质与SYBRGreen I法并无二致，同样需要使荧光信号的积累（增长）与PCR产物的形成保持同步。实现方法为：在探针的完整程度尚未被破坏时，报告基团发射的荧光信号会被淬灭基团吸收；当PCR处于扩增阶段时，Taq酶的5′-3′外切酶的活性将受探针酶的“切割”，进而降解。此时，报告荧光基团和淬灭荧光基团将会分离，之后便可使荧光监测系统收到相应的（荧光）信号。而随着一条DAN链的形成，一个新的荧光分子也会同时间形成。

2.3 等温扩增技术

等温扩增技术全称“基于恒温扩增的核酸扩增技术”，包含环介导等温扩增、交叉引物扩增、链替代扩增、重组酶聚合酶扩增、依赖核酸序列的扩增、依赖解旋酶的扩增和滚环扩增共7种具体类型[3]。受篇幅所限，本文以环介导等温扩增为例进行介绍。使用该技术检测克罗诺杆菌等病原菌的过程如下。①将内引物与目的基因相结合，在BstDNA聚合酶的作用下，可延伸为双链。②外引物与双链DNA的5′端会相互结合，并在一端形成环状结构。另一端经历的过程与此相同，最终会形成“两端都有环状结构，类似一个哑铃”的结构形态。③哑铃状结构形态的单链DNA兼具模板和引物的功能，一旦受到Bst聚合酶的催化作用，便可延伸。④内引物同样能够与环状结构相结合，并在聚合酶催化作用下延伸。相较于PCR技术，环介导等温扩增技术无需模板的热变形、温度循环等过程，在30～60 min内，即可完成对检测样本的核酸扩增反应，检测过程简单、快速且特异性较强。

2.4 其他技术

从克罗诺杆菌本身的特性出发，可针对其特点制定出一种专用于检测该菌的分子生物检测技术。比如克罗诺杆菌具有革兰氏阴性、α-葡萄糖苷酶活性、可产生黄色素等特性。基于此，有学者创设了一种只适用于克罗诺杆菌的检测过程。①使用必不可少的重要物质——万古霉素（一种糖肽类抗生素）和月桂基硫酸盐，目的在于：检测样本中可能含有多种真菌、细菌（其中的很多菌种并不具有致病性，但在检测过程中有可能影响对克罗诺杆菌的检测结果），需要抑制阳性细菌的生长，从而保证克罗诺杆菌等革兰氏阴性菌有较大的生长优势。②使用显色培养基对经过初步处理的样本进行培养，原理在于：克罗诺杆菌内独有的α-葡萄糖苷酶被活性水解后，会使培养基的第五颜色出现明显的变化。而考虑到检测样本中可能同时存在不止一种肠杆菌科细菌，故需借助硝基苯-α-葡萄糖吡喃苷等物质加以区分（体现在颜色方面，上文提到，克罗诺杆菌能够产生黄色素，故与硝基苯-α-葡萄糖吡喃苷等反应之后，培养基底物的颜色变化会产生明确的指向性，有助于检测人员判断）。③根据培养基底物颜色变化，进一步提出其他革兰氏阴性菌等杂菌之外，便可以根据克罗诺杆菌的发酵特性、氧化酶活性、柠檬酸水解活性等生化特性，再一次确定检测样本中是否真正含有克罗诺杆菌。该检测方式基于克罗诺杆菌的特性而设定，从原理上来说，只要有一个过程并不符合对应的结果，比如培养基底物颜色变化环节，如果并未出现克罗诺杆菌与硝基苯-α-葡萄糖吡喃苷反应后对应的颜色，实际上已经说明检测样本中不含有该菌。从相反方向进行分析，进入最后一个环节——基于发酵特性、氧化酶活性进行检测时，是为了对最终检测结果进行“定性”。

3 基于免疫学的快速检测技术

3.1 免疫磁珠检测技术

免疫磁珠是一种新型免疫学检测技术，是指将固化试剂的优点与免疫反应的高度特异性相结合，并基于免疫学开展的检测技术。具体原理为：运用核-壳的合成方法，完成含有超顺磁性物质高分子表面覆盖的复合材料，以及具有较强稳定性，能够进行后期标记物质的合成。在检测过程中，利用这些物质表面的功能集团（主要有氨基、羧基等），实现抗体的共价或非共价偶联。在此基础上，将特定的抗原或抗体（可视为检测样本）与上述物质相结合之后，在外加磁场的吸引作用下，检测样本中的很多物质会发生定向移动，进而完成分离、监测、基因纯化等目的。采用此种方法检测样本中是否含有克罗诺杆菌的原理为：克罗诺杆菌抗体能够与磁珠相结合，形成一种“抗克罗诺杆菌免疫磁珠”，可明显提升核酸检测灵敏度[4]。

3.2 酶联免疫吸附检测技术

该技术是指利用抗体分子、抗原分子特异性相结合的特点，使处于游离状态的杂蛋白和结合于固相载体的目的蛋白相结合。在此基础上，利用经过特殊标记的标记物，对检测样本进行定性、定量分析。具体而言，抗原或抗体会吸附在检测样本固相的表面，且免疫活性在很长一段时间内都能有效留存。此时向其中加入酶，可通过共价键形成酶结合物，并保持各自的免疫活性与酶活性。此时再加入检测底物，根据颜色的变化情况，可确定免疫反应是否发生。从一定程度上来看，此种技术与上文提到的克罗诺杆菌特定生物化学检测技术有部分相似之处。

3.3 重组酶等温扩增试纸条检测技术

此种技术是将重组酶聚合酶等温扩增技术与免疫层析试纸条技术相结合，形成一种能够在20 min内确定检测样本中是否含有克罗诺杆菌的技术。具体的检测过程如下。①将检测样本从-80 ℃的环境中取出，置于冰盒上，取100 μL加入10 mL LB液体培养基中，37 ℃、200 r·min-1过夜培养。次日取出，按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取细菌DNA，DNA于-20 ℃保存备用。②完成胶体金试纸条的制备。③选择NC膜，完成样品展开液的优化处理之后，重点针对检测样本的特异性和灵敏度进行检测。具体方法遵照GB/T 4789.40—2016标准。将检测结果与标准参照表进行对比，即可了解样本中是否存在克罗诺杆菌[5]。

4 结语

克罗诺杆菌对特定人群有较强的致病性，而感染人群（主要是婴幼儿）的途径包含多种食品（主要是婴幼儿奶粉）。从保证食品安全角度来看，针对流入市场的食品进行全方位检测是必要的，也是无可置疑的。但从行业发展及管理的角度来看，检测过程耗时同样是大问题。如一些新鲜的果蔬，如果检测时间较长，新鲜度便会降低，导致卖不上价。基于此，必须找到能够在短时间内精准确定样本中是否含有克罗诺杆菌的方法。本文介绍的PCR技术，针对克罗诺杆菌的特定检测技术都能够产生良好的效果，可推广应用。