H型血管在骨质疏松症中的研究进展

张志秀 刘静 曾佩芸 钱子冰 张琦

1.甘肃中医药大学第一临床医学院，甘肃 兰州 730000 2.甘肃省人民医院，甘肃 兰州 730000

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种骨吸收速度大于骨形成导致退变的疾病，具有骨微结构退化、骨密度(BMD)低的特点，常伴有骨折、疼痛和身体限制，给人类带来巨大的痛苦[1-3]。据估计，全世界有2亿女性患有此病，每年造成超过890万例骨折，50岁以上的中国人每年导致约68.7万人髋部骨折[3]。虽然在针对该病的机制方面取得了进展，但目前的治疗效果仍然不太理想[1]。有研究[4]报道在小鼠骨骼系统中发现新型毛细血管亚型，其具有特殊的形态、功能和分子特性。这些血管具有特定的结构，可参与骨内血管的生长，维持血管周围骨祖细胞的数量，并结合血管生成与骨生成[5]。研究发现老年动物骨中血管和骨祖细胞的数量明显减少，这在药理学上是可逆的，可以恢复骨量。因此，本文就H型血管在骨质疏松症中的研究进展做一综述，以进一步为骨质疏松症的进展提供新的研究目标。

1 H型血管的结构及功能

血管是由多种类型的细胞组成的，其中内皮细胞(endothelial cells，ECs) 在血管形成、血管生成和止血过程中起着关键的调控作用[6]。骨血管内排列着分化的血管内皮细胞，具有特殊的形态、功能和分子特性。Kusumbe等[4]在小鼠生长板附近的小梁骨和皮质骨中以及在骨膜和骨内膜表面发现了一种特殊的血管亚型，根据内皮细胞表面标志物的差异，分为H型血管和L型血管。H型血管中血小板内皮细胞粘附分子-1(CD31)和内粘蛋白(endomucin，EMCN)高表达，L型血管中CD31和EMCN低表达。H型血管位于干骺端生长板附近，同时位于骨干的骨膜和内层及关节软骨下，周围聚集着着大量的 Osterix+骨祖细胞，通过产生特定因子进而刺激骨髓中骨祖细胞增殖和分化，积极引导骨形成。研究发现H型血管和骨祖细胞的数量与年龄呈现负相关，随年龄增加而减少，为老年性骨质疏松症的诊治提供了新的措施[4,6-8]。随后王亮等[9]研究中，他们通过收集股骨近端转子间骨折并行近端髓内钉固定术后患者的骨标本，证实人骨组织中也存在这种血管。后来，Gao等[10]从髋关节置换术患者的股骨头中分离血管内皮细胞，使用免疫荧光染色检测血管内皮细胞CD31和EMCN的定位，一周左右在显微镜下观察细胞形态，发现融合后细胞形成单层，呈束状排列，轮生状，生长呈贴壁抑制，细胞多呈短梭形、多角形和鹅卵石样形态特征，证实在人股骨头内存在H亚型血管内皮细胞(HSVECs)。经对照组、骨质减少组和骨质疏松组的比较显示，H型血管与骨量减少的关系紧密，认为人类H型血管的密度是骨量减少的早期标记，可通过生成H型血管来增加骨量[11-12]。

2 参与H型血管生成与成骨的细胞因子

2.1 破骨细胞前体细胞分泌的血小板源性生长因子(PDGF-BB)

PDGF- BB(platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB)是PDGF家族中参与趋化和有丝分裂，在促进各种间充质细胞迁移、增殖和分化以促进血管生成和成骨过程中起关键作用的因子[13-15]。Xie等[16]在OVX(去卵巢骨质疏松小鼠模型)小鼠体内发现CD31hiEmcnhi血管减少，而破骨细胞前体细胞分泌的PDGF-BB可以诱导H型血管(CD31hiEmcnhi)血管生成，刺激骨形成，他们认为破骨细胞前体细胞是骨髓和外周血中PDGF-BB的主要来源,同时敲除组织蛋白酶K(Ctsk)或注射其抑制剂可有效增加PDGF-BB的水平，Ctsk抑制剂还可增加OVX骨质疏松小鼠的血管生成和骨生成[16-17]。研究发现蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2可诱导破骨细胞前体细胞向破骨细胞的转化，实验人员给3个月大的OVX小鼠体内注射SHP-2 抑制剂(NSC-87877)，发现NSC-87877可诱导骨质疏松小鼠骨髓中CD31hiEmcnhi血管和破骨细胞前体细胞的数量增加，PDGF-BB水平升高。体外实验也表明，NSC-87877可防止破骨细胞前体细胞融合，增加PDGF-BB的产生，增强破骨细胞前体细胞促血管生成能力[18]。Jie等[19]通过给OVX小鼠体内灌Harmine乳剂，2个月后取骨标本进行μCT、HE、免疫组化和免疫荧光分析，评价骨量、成骨和破骨活性以及H型血管数量，发现去卵巢小鼠经Harmine乳剂处理后，骨髓中PDGF-BB水平升高，骨中H型血管明显增多，认为Harmine乳剂可能通过抑制破骨细胞形成和促进破骨细胞前体细胞源性PDGF-BB的分泌来促进血管生成。后期Shangguan等[20]发现地塞米松可以通过抑制PDGF-BB下游的PDGFFRβ/FAK信号通路诱导H血管发育不良，增加骨质疏松的易感性。

2.2 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)

VEGF(尤其是VEGF-A)作为一种趋化分子，其分泌是成骨和血管生成偶联所必需的,通过将内皮细胞吸引到骨组织中，从而调控成骨细胞和破骨细胞的分化与功能，参与骨重建[21-23]。有研究利用特异性缺失VEGFA转基因小鼠的成骨细胞，在通过膜内成骨发生修复的区域，血管生成和成骨耦联需要最佳水平的VEGF，证明了VEGF在炎症阶段可趋化巨噬细胞募集和血管生成反应，猜测其可能在这一过程中起旁分泌的功能。此外，另有研究[24-25]显示肥大的软骨细胞以及成骨细胞来源的VEGF刺激破骨细胞和血管的募集，并在骨膜软骨内成骨阶段促进修复部位的软骨吸收。PDGF-BB可以增强内皮祖细胞中的VEGF信号，以保护内皮细胞管的形成[17]。但是，VEGF调控H型血管生成与骨生成具体机制还有待研究，同时骨质疏松治疗可能会影响循环中VEGF的水平，因此，需要进一步研究以确定VEGF是否在骨质疏松中起因果作用。

2.3 缺氧诱导因子 HIF-1α(hypoxia-induced factor 1α)

HIF-1α是一种异源二聚体转录因子，介导细胞对氧变化的反应，并调控生理性以及病理性新生血管的生成。内皮细胞中缺氧信号导致H型血管数量增加，从而促进软骨内血管生成和成骨过程[14,26]。Kusumbe等[4]在实验中发现H型和L型两种类型的骨血管内皮细胞，这两种类型血管内皮细胞在HIF-1α和表面标志物的表达水平上存在差异，HIF-1α在H型血管内皮细胞中明显表达，定位于软骨-骨交界处附近，还表现出CD31hiEmcnhi的强烈表达，而L型内皮细胞定位于骨干的窦状血管，以CD31和EMCN低表达为特征。同时发现幼鼠体内HIF-1α在H型内皮细胞高表达，且表达水平随着幼鼠年龄的增长而降低，证明年龄依赖性的骨量丢失与H型内皮细胞的减少有关。ECs特异性分泌的HIF-1α的缺失导致骨祖细胞显著减少，并伴随着骨小梁形成的减少[27]。Wang等[11]通过对去卵巢小鼠(OVX)腹腔注射去铁胺(DFO)4周后发现H型血管和骨祖细胞的数量增加，DFO可抑制脯氨酰-4-羟化酶，从而增强HIF-1α的活性和稳定性，诱导血管生成信号上调，促进血管生成和增加去卵巢小鼠H型血管，导致骨量显著增加，有潜力作为理想靶点来治疗骨质疏松，诱导骨生成。

3 参与H型血管生成与成骨的其他因素

3.1 Notch信号通路调控H型血管的形成

Noch信号通路在胚胎发育、细胞增殖、分化和动态平衡等过程中起着重要的调节作用。自从Dexter和Morgan发现了带缺口翅膀的突变果蝇以来，已经有大量的研究和动物模型阐明了Notch信号的生理和病理作用。Notch受体及其配体是跨膜蛋白，通过细胞与细胞间的物理作用启动其信号级联反应。人类有四种Notch受体(Notch1～4)和五种不同的Notch配体(JAG1、JAG2、DLL1、DLL3和DLL4)[28]。Notch信号通路参与了骨骼细胞的增殖、分化和凋亡，调节骨骼发育和骨重塑，并且已经在转基因动物模型和体外进行的研究中证实，对骨骼细胞的活动和骨骼发育至关重要[14,29]。Ramasamy等[30]对小鼠体内Notch信号进行遗传干扰后，发现小鼠不仅H型血管的形态与生长受到损害，还会导致成骨障碍、长骨变短、软骨细胞突变、骨小梁缺失和骨量下降。给予重组Noggin(一种分泌型骨形态发生蛋白拮抗剂)可恢复骨生长和矿化、软骨细胞成熟、小梁形成以及内皮细胞特异性Notch信号途径突变体中的骨祖细胞数量，证实内皮细胞Notch信号活性可促进骨内H型血管形成和成骨。

3.2 低强度脉冲超声促进骨H型血管的形成

1983年，Xavier和Duarte首次使用低强度脉冲超声(low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS)加速人体骨折修复过程[31]。此后，人们对LIPUS的效果进行了大量的研究，最近，LIPUS作为骨折愈合的一种无创辅助治疗方式已在临床试验中报道，证据表明，LIPUS在治疗骨折和延迟骨不愈合、修复肌腱和韧带以及改善脊柱融合方面是有效的。此外，LIPUS对四肢骨折有很强的疗效，可以增加软骨细胞和成骨细胞的产量，加速骨痂的形成[32]。其次，研究发现LIPUS可以加速脊柱融合，使H型血管增多。对40只雄性SD大鼠进行单节段单侧脊柱后关节融合术，随机分为LIPUS组和对照组，各20只，LIPUS组术后第三天开始使用LIPUS，术后两周发现两组中均出现CD31hi微血管，血管稀疏，LIPUS组高于对照组，术后4周，LIPUS组和对照组的平均血管密度分别为(3.22±0.56)%和(1.81±0.60)%(P<0.01)，LIPUS组与对照组相比，Emcnhi微血管明显增多，证实LIPUS能显著增加脊柱融合过程中的成骨细胞数量，这一过程与H型微血管生成增加有关[33]。Wu等[32]建立创伤性椎体骨折大鼠模型，术后采用LIPUS治疗，术后4周采用X线摄片、计算机断层扫描、三维重建等方法评价骨愈合情况，组织学分析评价成骨过程及与H型微血管的关系。LIPUS治疗组与对照组相比，小梁网重塑良好，骨折处形成丰富的软骨细胞、骨髓腔、骨小梁和H型微血管，证实低强度脉冲超声可增加创伤性椎体骨折模型中软骨、成骨细胞以及H型微血管的生成，促进创伤性椎体骨折愈合。

3.3 MiRNAs调控血管生成与成骨

MiRNAs是一种进化上保守的内源性非编码小RNA片段，长度为20～22个碱基对，参与真核基因的转录后调控。研究发现，单个miRNA可以靶向调控多个基因，因此基于miRNA的基因治疗是一种发展迅速的疾病治疗策略，在治疗骨质疏松症方面有很大的潜力[34]。此外，Yang等[35]发现miR-497～195群在CD31hiEmcnhi内皮细胞中丰富度高，并随着年龄的增长呈负相关，内皮细胞miR-497～195群缺失的小鼠CD31hiEmcnhi血管较少，骨量较低。相反，在小鼠内皮细胞中过表达miR-497～195群可以减轻与年龄相关的CD31hi血管减少和骨量丢失。MIR-497～195群分别通过靶向F-box和WD-40结构域蛋白(Fbxw7)和具有跨膜结构域的脯氨酰4-羟化酶(P4HTM)来维持内皮Notch活性和HIF-1a的稳定性，研究表明miR-497～195群可以调控血管生成和成骨，可能成为治疗老年性骨质疏松症的新措施。

3.4 E型内皮细胞

近年来，Langen等[36]报道了一种强烈支持成骨细胞系的特殊内皮细胞亚型，其存在于胚胎以及出生后早期长骨，称为E型，E型内皮细胞可分化为H型内皮细胞，与H型毛细血管相比，E型血管与Osterix+骨祖细胞的相关性更强，细胞基质信号通过指定发育成骨过程中的骨内皮细胞来调节骨生成。

3.5 锌指转录因子ZEB1

锌指E盒结合同源框1(ZEB1)是一种锌指转录因子，可触发上皮-间充质转化(EMT)程序，对正常发育和病理状态至关重要[37]。锌指转录因子ZEB1在人和小鼠骨内的H型血管内皮细胞中强烈表达，小鼠内皮细胞特异性缺失ZEB1会损害骨内CD31hi血管的形成，导致成骨减少。从机制上讲，ZEB1缺失减少了DLL4和Notch1启动子上的组蛋白乙酰化，从而抑制了控制骨血管生成和成骨的Notch信号。ZEB1在骨质疏松症小鼠和人类骨骼内皮细胞中的表达下降，给骨质疏松小鼠注射ZEB1包装的脂质体可以恢复受损的骨骼内皮Notch活性，进而促进血管生成依赖性的成骨，改善骨量丢失，药物逆转低ZEB1/Notch信号可能通过促进血管生成依赖性骨形成对骨质疏松患者发挥治疗作用[38]。

4 小结与展望

骨是一种高度血管化的结缔组织，骨骼血管在骨发育、再生和重建过程中起着重要作用[39-40]。在小鼠和人体骨骼系统中发现H型血管，显示H型血管生成与骨生成存在耦合，认为H型血管的密度是骨量减少的早期标记，可作为诱导H型血管来改善骨质量的新措施[4,11,30]。目前骨质疏松症的治疗主要集中于靶向抑制破骨细胞骨吸收或合成代谢疗法刺激成骨细胞骨形成，由于它们的生物利用度有限和其他有害的影响，治疗效果不是很理想。随着我国人口逐渐进入老龄化，骨质疏松症的发病率也在逐渐升高，成为公共卫生一大难题。相信在未来，改善H型血管在骨量丢失方面的研究将会为骨质疏松症的诊治提供一条很有前途的研究方向。