骨髓脂肪的分析技术及其与骨质疏松关系的研究进展

王思竹 汤光宇

同济大学附属上海市第十人民医院放射科，上海200072

骨质疏松(osteoporosis，OP)是一种由于骨量、骨质量衰败使得脆性骨折风险增加的骨骼疾病[1]。OP脆性骨折具有高发病率、高致残率特点，明显增加了国家医疗卫生负担，降低了人们的生活质量，随着人口的老龄化，OP已经成为了一种重要的公共卫生健康问题[2]。骨骼由矿化骨组织和骨髓组成，前者主要包含骨细胞，占骨骼细胞总数的90 %～95 %[3]。OP的临床特征是骨密度(BMD)降低，一般通过双能X射线吸收法(DXA)或定量计算机断层扫描(QCT)进行测量[4]。既往的研究主要集中在OP骨的矿化骨成分，但近期的研究发现非矿化骨成分对骨形成同样具有影响，其中非矿化骨成分的组成之一就是骨髓脂肪，其曾经一度被认为是骨髓的惰性组成成分[5-6]。但近年越来越多的研究发现骨髓脂肪能够影响骨量与骨质量[5]，然而，其具体机制仍不清楚。因此，为了明确OP骨中骨髓脂肪的成分及其变化，许多学者通过质谱、CT或MR等多种手段对骨髓脂肪进行量化研究[7-8]。此外，不同骨髓脂肪酸在OP形成过程中的可能作用也同样被广泛探讨[3,9]。本文综述了目前检测骨髓脂肪酸的手段以及其优劣性，OP骨中骨髓脂肪的变化特点以及不同骨髓脂肪酸对OP形成的可能作用。

1 骨髓脂肪酸测量的方法

1.1 质谱分析法

质谱(MS)是在真空磁场中，通过测量低压下电离分子的质荷比(M/Z)来研究分子结构的一种方法。然而，由于可变电离和离子抑制的影响，质谱分析对高度复杂样品的精准测量仍然存在困难，为了弥补这个局限性，在进行质谱分析之前，通常会使用色谱法来降低样品的复杂性[10]。

1.1.1气相色谱-质谱法(GC-MS)气相色谱法(GC)主要通过一个含有特殊涂层的柱体分离化合物，在高温下，惰性气体(常为氦气)将已经被蒸发、汽化的检测样品进行推动，并与色谱柱上的涂层相互作用，根据检测样品中不同物质与柱体涂层的作用不同，导致不同的保留时间，从而在挥发性分子进入质谱仪之前提供有效的分离。最后，由质谱仪输出样品的质谱，其中每个峰或条代表一个具有特定质荷比的离子，峰的长度代表相对丰度。尽管气相色谱-质谱法是一种很好的测定挥发性样品的方法，但其局限性主要体现在衍生化这一步骤，操作繁琐，耗时长，并且得到的结果方差较大。此外，目标检测物的脂质可能会在衍生化过程中被降解或修饰，导致结果发生变化，影响结果的稳定性[11-12]。

1.1.2液相色谱-质谱法(LC-MS)LC-MS与GC-MS的工作原理相似，不同之处是它使用液体作为介质(通常是水和有机溶剂的混合物)，而不是气体。给定的样品被液体推进色谱柱内，色谱柱本身含有一种固体吸附剂，它可以减慢给定样品的通过速度，通过色谱柱的时间同样取决于它与吸附剂的相互作用的程度。因此，通过改变色谱柱和液体，可以分离出不同类型的物质并引入质谱仪。LC-MS可以用于热不稳定物质和大分子物质的检测，但其不能分离相同分子量的异构体[13]。

质谱技术是一种强大的物质鉴定技术，具有成本低、通量高、灵敏度和选择性高、初始样本量小、分析时间短等优点。然而，未知脂类的鉴定和结果重现性对质谱技术来说仍然是一个挑战[12]。此外，质谱技术的分析对象是已经分离的活体体液或组织，意味着对某些物质进行鉴定时需要有创操作获取标本组织[14]。

1.2 质子磁共振波谱(MRS)

MRS不仅可以用于检测体外样本，还可以用于活体内脂肪的分析[14-15]。不同质子所处的电子云环境不同，所产生的磁场具有差异，进而引起的化学位移不同，这是MRS识别不同物质的理论基础[16]。与GC-MS、LC-MS相比，MRS是一种无损检测技术，相同的样品不仅可直接用于生化分析，行MRS后的样品还可以进一步进行组织学或基因表达等的检测[17]。该技术的样品制备相对简单，但样品的pH值对MRS的结果有显著影响[14]。MRS是测量骨髓脂肪的金标准，与骨髓脂肪组织学结果高度相关[18]，能够通过分析单个体素或样本脂质峰曲线下面积得到被检测物质的脂肪分数，此外MRS还能够分辨不同的脂肪酸成分相对含量，例如饱和以及不饱和脂肪酸的比例[17]。由于活体MRS脂肪分析只能测量一个体素内的少量组织，所以无法识别物质的空间分布。对于脊柱或股骨近端等骨髓脂肪分布不均匀的部位，MRS无法得到更加全面的信息[19-20]。

1.3 MRI水脂分离成像

水脂肪分离成像或称MRI化学位移成像、Dixon法，因为水和脂肪的共振频率不同，该方法利用两者之间的化学位移差来分离水和脂肪的信号。它可以提供水分含量和脂肪分数，并且可以实现对脂肪的空间分布的分析[21]。当骨髓脂肪分布不均时，水脂分离成像弥补了MRS在空间分辨率上的局限性，且比其耗时更少[8,22]。研究[23-24]证明MRI水脂分离成像与MRS以及组织学结果也具有良好的相关性。然而，在使用水脂分离成像测量骨髓质子密度脂肪分数时，仍有若干因素会影响测量结果，比如脂肪质子多峰、T1值偏倚和T2*衰减效应[25]。此外，利用水脂分离成像准确定量骨髓脂肪组成仍具有一定困难，水脂分离成像与MRS各有优势，为了能够更加全面地检测骨髓脂肪，目前已有学者开发了一种优化版水脂分离成像技术，其既能够定量脂肪含量，并且也能够识别脂肪成分[8,26]。然而该技术仍处于起步状态，需要更多的研究证实其准确性以及实用性。

2 骨髓脂肪与OP

骨髓分为红骨髓和黄骨髓，红骨髓与黄骨髓中的脂肪细胞在一生中不同阶段的增殖速度是不同的。研究发现黄骨髓中的脂肪细胞自出生开始增殖，并且在1～2岁时增殖加速，脂肪细胞随着年龄的增长由外周骨向中轴骨聚集。在25岁左右时，黄骨髓中的脂肪细胞占据四肢长骨等大部分骨骼，而红骨髓仅局限于中轴骨以及股骨、肱骨近端干骺端[19]。

骨代谢包括破骨细胞诱导的骨吸收以及成骨细胞诱导的骨形成，这是一个持续终身的过程。OP主要是由于过度活跃的破骨细胞与相对静止的成骨细胞引起的不平衡所导致的过度的骨吸收[27]。骨髓脂肪细胞以及成骨细胞均起源于骨髓间充质干细胞(MSCs)，并且在细胞分化的过程中共享一些相同的步骤，在OP发生发展过程中，MSCs的分化可能由成骨细胞方向向脂肪细胞方向发生了转变，向脂肪细胞分化增加，将导致向成骨细胞分化的减少[3]。

OP与骨髓脂肪的堆积有关，根据文献报道，OP患者骨髓脂肪的比例较健康对照组更高，在60岁左右的健康人群中，骨髓脂肪约占45 %～60 %，低骨量患者的骨髓脂肪较健康人群高5 %，而OP患者又比低骨量患者骨髓脂肪增高5 %，骨髓脂肪量与骨骼微结构以及骨强度均呈负相关[28]。此外，治疗OP的药物如双膦酸盐、雌激素以及甲状旁腺素，也能够减少骨髓脂肪含量[28]。

OP患者不仅骨髓的脂肪含量增加，骨髓脂肪的组成也较正常人发生了改变，主要表现为饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸比例的变化。研究[29-30]发现，OP患者的骨髓不饱和脂肪酸比例下降，而饱和脂肪酸比例升高，不饱和脂肪酸的比例与骨折的发生率呈负相关的关系。一项基于有骨折史或DXA检查T值小于-2.5的绝经后女性的研究显示，该人群黄骨髓脂肪以及骨髓饱和脂肪酸比例增高，而红骨髓脂肪、单不饱和脂肪酸以及多不饱和脂肪酸比例均降低。此外，这种改变在骨骼的不同位置也是不同的。在股骨颈、Ward三角和股骨干中的骨髓脂肪组织和黄骨髓中观察到的饱和脂肪酸增高，不饱和脂肪酸降低，而红骨髓中质子密度脂肪分数和不饱和脂肪酸含量均降低[26]。然而，这种骨髓脂肪分布和组成变化的异质性在OP发病机制中的具体作用尚不明确，仍然需要更多的研究来阐明这种改变的重要性以及作用。

3 骨髓脂肪对OP形成的可能机制

长时间以来，骨髓脂肪被认为仅仅是骨髓的组成部分之一，是作为骨小梁扩大间隙的填充物，骨髓脂肪比例与骨密度之间的负相关关系是由于骨髓MSCs向成脂谱系过度分化的结果。事实上，目前研究发现骨髓脂肪细胞其实还是一种具有内分泌作用的细胞，它可以通过释放瘦素、脂联素、细胞因子以及脂肪酸等多种分子，发挥旁分泌或内分泌作用，这些被分泌的分子具有影响骨代谢的功能[31]。骨髓脂肪质量与骨代谢、造血功能的正常维持密切相关[28,32]。

瘦素以及脂联素均由骨髓脂肪分泌，与骨代谢息息相关。一方面，瘦素与骨髓MSCs上的瘦素受体结合后，会抑制脂肪细胞的形成，促进成骨细胞分化，并抑制破骨细胞的形成。而瘦素与中枢神经系统的细胞受体结合同样对骨骼能够产生间接影响，但是其作用却为抑制骨骼形成，并促进破骨细胞的分化[33-34]。另一方面，体外实验发现脂联素能够促进成骨细胞分化，并且增加骨量[28]。然而，在临床研究中，循环脂联素水平与较低的骨量相关，由此有研究认为脂联素是骨髓脂肪增加的标志[28]。虽然目前发现骨髓细胞来源的瘦素和脂联素与骨形成有关，但仍不清楚这些分子具体是如何影响或参与OP形成的，目前所发现的机制解释仍然有限，需要对其进行更加深入的研究。

一项研究发现，骨髓脂肪细胞表达的53种细胞因子在不同年龄群体中存在显著差异，并且与皮下脂肪相比，骨髓脂肪细胞表达的细胞因子具有促进脂肪形成、抗成骨细胞形成以及促进凋亡的作用。此研究发现随着增龄，Fc蛋白受体、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达显著升高，与破骨细胞数量和活性的增加相关。此外，一些已知能够抑制破骨细胞分化的细胞因子如干扰素、IL-4，在年长群体的骨髓脂肪细胞中表达减少。另一方面，在成骨细胞代谢中，研究发现IL-2、IL-5、骨保护素(OPG)和干扰素-γ的表达降低，这将影响成骨因子的释放[35]。

此外，骨髓脂肪还可以使得骨髓微环境中的脂肪酸水平升高，其中一些脂肪酸对成骨细胞和骨细胞能够产生不利影响。体外研究发现将游离脂肪酸添加至成骨细胞或破骨细胞的细胞培养基中，能够影响其功能以及存活情况。16∶0饱和脂肪酸和18∶0饱和脂肪酸能够通过诱导细胞的凋亡和自噬，从而损害成骨细胞的形成[3,36]。

棕榈酸(PA)是一种16∶0饱和脂肪酸，其可以通过诱导骨细胞凋亡，影响骨代谢，与OP改变有关[37]。PA还能够引起MSCs凋亡，减少其增殖，从而使得成骨细胞的数量随之减少，与骨量减少有关[38]。不仅如此，PA还能够通过诱导成骨细胞自噬以及凋亡，减少成骨细胞的数量，诱导成骨细胞自噬需依赖于自噬标志物(Beclin)以及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，而自噬是成骨细胞保护自身免受脂肪毒性的保护机制，PA能够通过内源性以及外源性途径促进成骨细胞凋亡[36]。成骨细胞的分化也受到PA的影响，通过降低转录因子SMAD的活性从而抑制骨形态发生蛋白-7(BMP-7)诱导的成骨细胞分化，进一步导致成骨标志物如核心结合蛋白因子2(Runx2)、骨钙素以及碱性磷酸酶(ALP)的表达减少[39]。而对于破骨细胞来说，PA主要通过上调破骨细胞分化因子受体(RANK)的表达水平，诱导内质网应激，激活核因子κB(NF-κB)和细胞外调节蛋白激酶(ERK)通路，从而促进破骨细胞分化，并且据报道，PA还能够在没有破骨细胞分化因子(RANKL)的情况下促进破骨细胞分化[36]。除了以上所述的作用，PA还能够诱导促炎反应，上调Toll样受体4(TLR4)的表达，增加IL-6和IL-8的表达与分泌，从而促进破骨细胞前体细胞分化为成熟破骨细胞，导致骨形成受损以及骨吸收增强[40]。而单不饱和脂肪酸油酸(OA)能够阻断PA对骨骼的不利作用，其机制可能是通过刺激PA酯化为三酰甘油并储存在脂滴中所产生的[40]。

单不饱和脂肪酸棕榈油酸(PLA)能够下调NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)以及ERK，抑制破骨相关基因如DC-STAMP以及骨吸收标志组织蛋白酶(CTSK)、基质金属蛋白酶9(MMP9)以及抗酒石酸磷酸酶(TRAP)的表达，抑制了肌动蛋白环的形成并阻断了破骨细胞溶骨能力，减少了TRAP染色阳性的破骨细胞数量，最终抑制RANKL诱导破骨细胞形成的通路，并促进成熟破骨细胞凋亡[36]。

而多不饱和脂肪酸(PUFA)也能够改变骨细胞的增殖情况以及功能，常见的多不饱和脂肪酸包括n-3长链多不饱和脂肪酸以及n-6长链多不饱和脂肪酸等。N-3长链多不饱和脂肪酸如二十碳五烯酸(EPA)以及二十二碳六烯酸(DHA)具有促进成骨细胞存活、促进成骨细胞形成以及防止骨吸收的作用[41-42]。EPA与DHA对成骨细胞的作用主要与抗炎作用有关，EPA以及DHA 能够通过减少花生四烯酸(AA)衍生的前列腺素E2(PGE2)的合成，从而调节过氧化物酶体增殖剂激活受体(PPARγ)信号，降低细胞因子如IL-1、IL-6和TNF-α的水平，进而抑制AA衍生的类花生酸的合成和环氧合酶以及5-酯氧合酶的活性[9,36]。DHA可以与细胞膜上的TLR4结合，从而抑制TLR4信号、MAPK通路以及NF-κB信号，进一步使得c-Fos和活化T细胞核因子(NFATc1)表达下调，而这两个因子是破骨细胞增殖和分化主要的调节因子[36]。此外，DHA通过抑制巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导的丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)激活和cyclinD1/D2的表达，从而抑制破骨细胞前体的增殖，通过促进细胞死亡调解子抗体(Bim)的表达，诱导成熟破骨细胞的凋亡[43]。EPA 还能够抑制MSCs凋亡，长期高剂量的地塞米松治疗会导致MSCs凋亡，而EPA通过激活G蛋白偶联受体(GPR)120以及RAS-细胞外调节蛋白激酶(Erk1/2)级联抑制这种凋亡[36]。α-亚麻酸(ALA)也是一种N-3长链多不饱和脂肪酸，其可以抑制NF-κB级联反应，并通过促进破骨细胞死亡、分化来抑制破骨细胞的形成，通过下调NF-κB-iNOS-COX-2信号通路减少骨量丢失，并抑制RANKL诱导的破骨细胞分化[36]。然而值得注意的是，研究发现AA作为一种N-6长链多不饱和脂肪酸，却能够降低成骨分化基因如Runx2、成骨细胞特异性转录因子(osx)以及ALP的表达，并降低骨保护素(OPG)/RANKL的比例从而诱导骨吸收，高浓度的AA还会抑制MSCs向成骨细胞分化，并且诱导其向脂肪细胞的分化[44]。

丁酸等短链脂肪酸可以通过促进骨唾液蛋白和骨桥蛋白的产生，促进成骨细胞的形成和分化，并促进成骨细胞分泌OPG，OPG是RANKL的诱导受体，通过与RANKL结合减少破骨细胞的产生[45]。此外，短链脂肪酸如乙酸和丙酸对破骨细胞上的GPR41具有较高亲和力，而GPR41具有调节瘦素产生的作用。丁酸和丙酸还能够诱导破骨细胞的代谢重编程，下调破骨细胞产生的关键基因如肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)和NFATc1[36]。中链脂肪酸癸酸能够通过抑制RANKL诱导的大鼠核因子κB抑制蛋白α(IkBα)磷酸化以及NF-κB转录，减少NFATc1的激活，从而减少破骨细胞的产生。癸酸还能够通过启动Bim表达并抑制ERK激活来促进破骨细胞的凋亡[36]。

因此，不同的脂肪酸对骨代谢的作用是不一样的。而且，上述很多研究结果仅在体外细胞培养基中获得，骨髓脂肪酸对骨代谢在人体体内的实际作用仍是不明确的。目前仅已知OP患者骨髓中不饱和脂肪酸比例降低，而饱和脂肪酸比例升高[30]，OP发生、发展过程中各类脂肪酸变化的规律性及其对OP骨的作用机制，均有待于未来研究。

4 总结

目前，检测骨髓脂肪的技术方法已取得了许多进步，现有的技术能够无创地对骨髓脂肪进行定质、定量的分析，MRS能够分析单个体素的脂肪分数以及不同脂肪酸成分相对含量，MRI水脂分离成像能够分析脂肪的空间分布并得出其脂肪分数。此外，现有研究也揭示了许多骨髓脂肪与骨代谢之间的相互作用，骨髓脂肪细胞通过内分泌以及旁分泌的作用，可能参与了OP的病理生理发展过程。然而，在活体内直接研究骨髓脂肪的代谢情况仍是一个挑战。脂质活体成像技术也处于起步状态，仍需要更多技术上的改进。骨髓脂肪酸参与骨质疏松的发病机制可能成为治疗骨质疏松的潜在靶点，未来需要进一步明确健康骨骼各种重点脂肪酸的实际需要量，从而改善日常饮食结构，保护骨骼的健康。