HPLC 法同时测定陈香露白露片中7 个成分的含量

张 璐，戴群芳，陈思思 （江西省南昌市检验检测中心, 江西 南昌 330000）

陈香露白露片的处方由陈皮、甘草、川木香、大黄、石菖蒲五味中药和碳酸镁、氧化镁、次硝酸铋、碳酸氢钠4 种化学药组成[1]。方中陈皮行脾胃之气[2,3]，为君药，主要活性成分为橙皮苷、川陈皮素、橘皮素，与甘草配伍，健脾祛湿[4]；甘草苷、甘草酸铵为甘草的主要活性成分；川木香具行气止痛之效[5]，广泛用于腹痛，食欲不振等，木香烃内酯、去氢木香内酯为其主要活性成分。加之碳酸氢钠等碱性药物中和胃酸[6]，共成健胃和中、理气止痛功效。

陈香露白露片目前执行的质量标准为《卫生部药品标准WS3-B-1 553-93》，该标准仅设置了化学药成分的质量控制参数，难以全面反映产品质量，存在较大的安全风险。为实现陈香露白露片内在质量的有效控制，本实验构建了同步测定陈香露白露片中甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、橘皮素、川陈皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯等7 种特征活性成分含量的HPLC 方法。该研究不仅为提高该制剂质量提供了有效、可靠的分析方法，同时对药品安全风险评估的有效实施也具有重要的研究意义。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260 高效液相色谱仪（安捷伦公司），配置DAD 检测器；XS105DU 电子天平、ME 204E 电子天平（梅特勒-托利多公司）；KQ-300DE 数控超声仪（昆山超声仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品甘草苷（批号：111610-201908，含量95.0%）、甘草酸铵（批号：110731-202021，含量96.2%）、橙皮苷（批号：110721-202019，含量95.3%）、川陈皮素（批号：112055-202001，含量99.6%）、橘皮素（批号：112054-202001，含量99.8%）、木香烃内酯（批号：111524-201911，含量99.9%）、去氢木香内酯（批号：111525-201912，含量99.5%）均购于中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈（色谱纯，赛默飞公司）；其余试剂均为分析纯（购于国药集团化学试剂有限公司）；实验用水为娃哈哈纯净水。16 批陈香露白露片样品来自3 个生产厂家：广西圣特药业有限公司（企业1），批号201207（S1）、190202（S2）、200506（S3）、210106（S4）、210107（S5）、210110（S6）、201102（S7）；贵州百灵企业集团制药有限责任公司（企业2），批号20191211（S8）、20210105（S9）、20210111（S10）、20201212（S11）、20201001（S12）；四川康福来药业集团（企业3），批号200902（S13）、200901（S14）、201202（S15）、200601（S16），以上样品规格均为每片重0.3 g。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相A 为甲醇，流动相B 为0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱（0～8 min，15% A；8～35 min，15% A→50% A；35～50 min，50% A；50～65 min，50% A→80% A；65～66 min，80% A→15% A；66～75 min，15% A），流速1.0 ml/min，柱温35 ℃，进样量10 μl，检测波长237 nm（0～15 min，检测甘草苷）、283 nm（15～25 min，检测橙皮苷）、237 nm（25～34 min，检测甘草酸铵）、330 nm（34～45 min，检测川陈皮素、橘皮素）、237 nm（45～75 min，检测去氢木香内酯、木香烃内酯）。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液

取甘草苷、橙皮苷、甘草酸铵、川陈皮素、橘皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯对照品适量，精密称定，用50%甲醇配制成浓度分别为55.72、1 108、307.2、56.25、18.75、26.01、58.95 μg/ml 的混合对照溶液。

2.2.2 供试品溶液

取陈香露白露片样品，研细，精密称取约1 g，置于锥形瓶中，精密加入25 ml 50%甲醇，超声30 min（功率250 W，频率33 kHz），放冷，精密称定，用50%甲醇补充损失的重量，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性供试品溶液

分别按陈香露白露片处方中各药比例制备缺陈皮、甘草、川木香的阴性样品，并按“2.2.2”项下方法制成缺陈皮、甘草、川木香的阴性供试品溶液。

2.3 系统适应性试验

对照品溶液、供试品溶液及缺陈皮、甘草、川木香的阴性供试品溶液按“2.1”项下色谱条件进行测定分析。结果如图1 所示，甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯等7 种成分与相邻峰分离良好，分离度均大于1.5；阴性样品中其他成分色谱峰均未对7 种成分产生干扰，表明该分析方法专属性良好。

图1 陈香露白露片HPLC 色谱图

2.4 线性范围考察

精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液0.10、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00 ml 置于5 ml 容量瓶中，用50%甲醇稀释，制备6 个浓度的对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件进行测定，并绘制标准曲线，其中横坐标为对照品的浓度（X，μg/ml），纵坐标为峰面积（Y）。7 种成分线性范围、线性回归方程与相关系数见表1。结果显示，7 种成分分别在各自浓度范围内线性关系良好。

表1 7 种成分的线性范围、线性回归方程与相关系数

2.5 精密度试验

取“2.2.1”项下对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复测定6 次。结果显示甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯峰面积6 次测定结果的RSD 分别为0.37%、0.38%、0.39%、0.42%、0.48%、0.75%、0.67%，表明该仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

按“2.2.2”项下方法平行制备6 份陈香露白露片（批号：20210105）供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果显示甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯的含量依次分别为1.158、4.002、10.68、0.063 3、0.147 7、0.132 3、0.292 7 mg/g，其RSD 分别为0.62%、0.65%、0.64%、1.05%、1.62%、0.87%、1.28%，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液（批号：20210105），放置 0、4、8、12、16、20、24 h 后，按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果显示甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯峰面积的RSD 依次分别为0.54%、0.68%、0.72%、1.02%、0.85%、1.60%、1.32%，表明该供试品溶液在24 h内具有良好的稳定性。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的陈香露白露片（批号：20210111）9 份，每份约0.5 g，精密称定，基于样品中7 种成分的含量分别按低、中、高3 种浓度水平加入对照品溶液（每个浓度各3 份），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果显示7 种成分的回收率分别为98.71%、98.12%、98.44%、98.22%、99.17%、99.18%、97.93%，RSD 分别为0.16%、0.67%、0.57%、0.62%、0.48%、0.56%、0.58%，表明该方法准确性高。

2.9 样品含量测定

取16 批陈香露白露片样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并在“2.1”项下色谱条件测定样品。外标法计算16 批次样品中7 种成分的含量，结果见表2。结果显示16 批样品中甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯的含量分别为0.125 0～1.174、2.354～7.426、1.822～27.21、0.037 0～1.399、0.072 3～0.443 3、0.014 0～0.199 0、0.220 7～1.407 mg/g。

表2 16 批样品中7 种成分含量测定结果(mg/g，n=2)

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

本实验色谱条件参考《中华人民共和国药典》（2020 年版）一部，237 nm 为甘草苷、甘草酸铵的检测波长[7]，225 nm 为木香烃内酯、去氢木香内酯的检测波长[7]，对两个检测波长均进行了待测成分响应值及专属性的考察，结果显示各成分在237 nm 波长处响应值均较高且与杂质峰分离良好，故最终选择237 nm 作为甘草苷、甘草酸铵、木香烃内酯、去氢木香内酯等4 种成分的检测波长。而橙皮苷、川陈皮素、橘皮素均参考药典上的检测波长[7]。陈香露白露片中所含成分复杂，等度洗脱很难将7 个化学成分同时分离，故采用梯度洗脱。

3.2 聚类分析

利用SPSS 软件以16 批陈香露白露片中7 种有效成分含量作为变量进行聚类分析。结果如图2所示，16 批样品以度量值11 为阈值，聚分为2 大类，其中一大类主要为企业2 和3 的样品，另一大类主要为企业1 的样品。结果表明由于企业缺少对该品种中重要指标成分的含量控制，导致产品在不同企业，以及相同企业不同批次之间质量差异较大。

图2 16 批样品测定结果聚类分析图

3.3 含量分析

由表2 得知，16 批陈香露白露片7 种主要成分含量差异较大。其中，橙皮苷含量差异主要表现在不同生产企业之间，主要原因可能是各生产企业使用了不同产地、不同采收期、不同生长年限的原药材导致的差异。而去氢木香内酯含量差异主要表现在同一生产企业的不同批次之间，其原因可能是药材养护措施不当、生产工艺控制参数不合理导致挥发性成分去氢木香内酯损失产生的差异。基于上述研究，建议生产企业加强对陈皮、甘草、川木香等原药材中关键活性成分的质量控制，建立高于《中华人民共和国药典》的内控标准，严格按批准的处方和生产工艺进行投料与生产，进一步提高陈香露白露片的质量一致性，从而实现其疗效的稳定性和有效性。