ApoB100 对肝脏VLDL合成分泌的影响及其在兽医临床中的研究进展

2022-12-06范文文高畅鸿邹存志张冰冰

现代畜牧兽医 2022年7期

范文文，王爽，高畅鸿，田艳，邹存志，徐闯，张冰冰，杨威

（1. 黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319 ；2. 黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江大庆 163319）

脂肪肝（fatty liver）是泌乳早期奶牛的主要代谢疾病，与健康状况和繁殖性能下降有关。奶牛脂肪肝由多种因素引起，肝脏内脂质过量蓄积是脂肪肝发病的主要因素[1]。奶牛患脂肪肝后，肝脏中蓄积大量脂肪，可导致肝脏合成能力减弱，从而使肝脏免疫应答有关的复合物能力降低，造成肝脏代谢化合物、代谢产物以及代谢激素发生改变，也会导致免疫功能减弱，影响繁殖性能及泌乳能力。因此，预防脂肪肝发生并有效治疗可降低奶农的损失。

肝脏是脂肪代谢的中心器官，通过分泌极低密度脂蛋白（VLDL）运输内源性合成的甘油三酯（TG），还可将一部分胆固醇和胆固醇酯输送至外周组织。奶牛患脂肪肝后，除血液中非酯化脂肪酸（NEFA）浓度升高外，还会引起VLDL 浓度升高[2]。VLDL 分泌紊乱时会引起TG 积累，导致疾病发展。载脂蛋白B100（ApoB100）作为VLDL 的主要蛋白质成分，能够调控VLDL 的合成和分泌速率，为组装和分泌富含TG颗粒所必需。肝脏VLDL的组装一直是深入研究的主题之一，ApoB100 作为肝脏合成分泌VLDL必不可少的载脂蛋白，也一直是研究奶牛脂肪肝发病机制的热点。

1 VLDL的合成与分泌

1.1 VLDL的原料组成

VLDL 是由肝脏利用乳糜微粒残粒、胆汁酸、脂肪酸、糖和蛋白质的中间代谢物与肝脏内合成的载脂蛋白共同组成的一种脂蛋白[3]，大小约为30～80 nm，含有TG、胆固醇、胆固醇酯和磷脂，其中TG为主要成分，含量约占60%。VLDL蛋白质部分包括ApoB100、ApoA1、ApoC、ApoE等，其中ApoB100是VLDL的核心结构蛋白，每个VLDL颗粒包含一个ApoB100分子[4]。

1.2 VLDL的生物学功能

肝细胞在系统性脂质稳态中的一个主要功能是内化循环脂质。对脂酸进行加工，并将细胞代谢不需要的脂肪酸融入TG、胆固醇酯和膜酯，之后作为VLDL释放至血液中[5]，此过程主要依赖TG的可用性，用于组装VLDL的TG在内质网腔中合成，以预防游离脂肪酸流入。

向肝脏提供的游离脂肪酸主要有3 种来源，即脂肪细胞的游离脂肪酸、乳糜微粒残留物以及肠道经门静脉[6]。无论是血液运输到肝细胞的脂肪酸，还是糖代谢转变形成的脂肪酸，在肝细胞中均可合成TG。在肝细胞内，TG 与ApoB100、胆固醇等结合，形成VLDL并释放入血。VLDL从肝脏向周围组织输出脂质，是低密度脂蛋白（LDL）的前体，主要负责将肝脏中合成的内源性TG运输到周围组织，提供了能量来源[7]。

1.3 VLDL的组装和分泌

VLDL 的生物合成及其由肝脏分泌到循环系统中是1 个复杂且受到高度调控的过程，在整体脂质稳态中起到重要作用[3]。VLDL 的生物合成发生在内质网腔内，分为两步完成：第一步是新翻译的ApoB100通过粗糙的内质网膜进行易位，一部分新生的ApoB100 被脂化，形成了1 个缺乏脂质的原始VLDL粒子。微粒体TG转移蛋白（MTP）能够将中性和极性脂质转移至发展中的VLDL粒子，促进了VLDL 的生物合成[8-9]。除MTTP 外，酵母Hsp110 可防止ApoB 的降解。Hrizo 等[10]将Hsp110 在哺乳动物细胞中过表达，结果发现，Hsp110、Sse1p 可能有助于Hsp70 或Hsp90 依赖性ApoB 的共翻译降解，表明ApoB 可看作是Hsp110的作用位点。

第二步是原始VLDL 颗粒从定位于内质网腔的脂滴中接收脂质，脂质通过脂质融合或腔内TG水解，之后酯化转移至高尔基体，发生进一步膨胀[5]。有研究提出，Cideb（细胞死亡诱导DFF45 样效应物的同源物）蛋白也在含有ApoB100 的脂质化不良原始VLDL 颗粒的脂质化中起到了一定作用；小鼠试验表明，Cideb通过与ApoB100相互作用，并将脂滴中的TG 转移至更高密度的VLDL 前体，在VLDL脂化和成熟中起重要作用[11]。

2 ApoB100对肝脏VLDL合成分泌调控特征

2.1 ApoB100的结构和功能

载脂蛋白B（ApoB）是一种存在于血浆脂蛋白中的大型两性亲糖性蛋白，分子量约为515 kDa，属于载脂蛋白。根据氨基酸组成不同，可将ApoB 分为两种亚型，分别为ApoB48 和ApoB100[12]。ApoB48 是哺乳动物肠道内主要的亚型，通过产生终止密码子Apobec-1 介导的位点特异性mRNA编辑合成[13]，存在于乳糜微粒及其残余物中。在人类及哺乳动物肝脏中，ApoB100 为主要成分，存在于VLDL、中密度脂蛋白（IDL）和LDL 上，并在肝脏中表达。而在大鼠和小鼠体内，上述两种亚型均在肝脏内合成，可以组装成VLDL[14]。

ApoB100是完全翻译的蛋白质，具有广泛的疏水性斑块和多个分子内二硫键。ApoB100 折叠并组装成新生的VLDL 前体颗粒需要在内质网中进行处理，在高尔基体中发生更多的VLDL 前体成熟，以达到分泌能力状态[15]。ApoB100作为肝脏合成分泌VLDL必不可少的载脂蛋白，是低密度脂蛋白受体（LDLR）介导的LDL颗粒内吞作用的配体，也是血浆中乳糜微粒和LDL 主要的组成蛋白，主要通过肝脏表面的LDLR 介导细胞内吞作用清除脂质代谢的残余物[4]。

ApoB100组装成VLDL 大致可分为两个步骤：翻译过程中，通过MTP 将脂质转移至ApoB100 以及载脂蛋白前体粒子与TG液滴融合形成成熟的VLDL。磷脂酶可能启动第二步融合所需的膜运输步骤，引导磷脂进入VLDLTG生产途径，VLDL生产主要控制在分泌前降解水平[16]。

2.2 ApoB100影响VLDL合成分泌机制

VLDL和乳糜微粒的合成与分泌受到脂质和蛋白质的影响。食物经过胃及小肠被消化后，进入小肠的胆固醇以乳糜微粒的形式进入血液中，在肝脏中与ApoB 转化为富含TG 的VLDL，其中的TG 被水解，转化为富含胆固醇的LDL。LDL 中的ApoB 能够特异识别LDLR 并与之结合，经胞内吞饮作用送至溶酶体中降解，从而清除循环中大部分的LDL。若编码ApoB 的遗传物质发生变化，可引起ApoB结构改变，无法识别LDLR，进而引发其水平升高，还可引起脂质代谢紊乱。

ApoB100是VLDL 组装和分泌所必需的蛋白质，且每个VLDL均具有一个相应的ApoB100分子，使ApoB100的可用性成为决定VLDL粒子数量的关键因素，进而决定了肝细胞分泌的TG[17]。但与大多数肝脏分泌蛋白的合成不同，肝脏中的ApoB100通常并非由其相对恒定的合成水平调控，而是由共降解和翻译后降解调节，此现象首次在人类HepG2 细胞和大鼠原代肝细胞中观察到。研究表明，ApoB100在细胞内发生降解，在原代肝细胞中降解不太明显，但在一些肝癌细胞系（如典型的HepG2 细胞）中，几乎80%新合成的ApoB100可通过此类降解去除[18]。

2.3 ApoB100在肝脏中的降解

与许多其他分泌的肝脏蛋白质相比，ApoB100的分泌主要由共降解和翻译后降解调节。此过程发生在VLDL组装和成熟期间。ApoB100 的产生主要受细胞内降解的调节，蛋白酶体途径是降解的主要机制。ApoB100的产生受到多种降解途径的影响，目前已报道的ApoB 降解位点有3个：

（1）由蛋白酶体介导的内质网关联降解（ERAD)。ERAD 作为分泌途径中的蛋白经典途径，至少包括3 个步骤，分别是底物识别、从内质网转位到胞质和泛素化以及在蛋白酶体中降解。上述步骤需要腔内伴侣、完整膜蛋白、胞质伴侣和蛋白酶体间的合作，其中一些ERAD 成分参与了ApoB100 的蛋白酶体降解。细胞脂质缺乏或脂质转移时，ERAD 途径最活跃。在此情况下，脂蛋白组装所需的新合成ApoB100较少，而相对过量的ApoB100会被蛋白酶体降解[19-20]。

在限制脂质供应的条件下，如微粒体TG 转运蛋白活性或脂质可用性降低，导致ApoB100在内质网上转位至泛素-蛋白酶体系统的过程中未能脂化，此过程称为内质网关联降解。Fisher 等[19]研究发现，减少ApoB100 的泛素化可增强VLDL的组装，而改善ApoB100的脂化则会降低其泛素化，表明ApoB100 对VLDL 组装过程具有调节作用，且ERAD是ApoB100组装成VLDL的关键降解位点。

（2）新合成的ApoB100 在到达细胞表面时，遇到LDLR 或硫酸肝素蛋白聚糖被内化，并进行溶酶体降解的再摄取途径。sortilin 作为参与高尔基体到溶酶体运输的多配体分选受体，与ApoB100 具有高亲和力，在高浓度条件下可能会引导ApoB100，促进溶酶体降解[21]。LDLR 在调节含有ApoB100的脂蛋白分泌方面具有重要作用；有研究表明，LDLR 不仅与细胞表面的ApoB100 相互作用，在分泌途径的早期与ApoB100 也会发生相互作用[22]。上述相互作用对ApoB100的翻译后降解具有重要意义。

Twisk 等[23]探究了野生型和LDLR缺陷小鼠肝细胞中LDLR的存在与脂蛋白分泌之间的关系，研究表明，LDLR的缺失对ApoB100的再摄取途径存在不同程度的影响。

（3）后内质网分泌前蛋白水解过程（PERPP）是指ApoB100 在离开内质网后受调控的降解。PERPP 是一种非蛋白酶体途径，由体外和体内多种代谢因子引起，包括细胞内脂质过氧化，如sortilin 介导的ApoB 降解[14]。sortilin 1 是miR-378a-3p 直接作用的靶点。Zhang 等[24]研究发现，在高脂血症的状态下，miR-378a-3p 在肝脏内通过抑制sortilin 1 作为跨膜运输受体的功能进行特异性表达，能够促进VLDL的肝脏分泌，提高了VLDL或LDL、胆固醇以及TG的水平。

PERPP 是在肝脏来源的细胞内降解新合成ApoB100的新途径，通过翻译后降解调节，减少了肝脏细胞的脂蛋白分泌。该途径通过饮食多不饱和脂肪酸，在肝细胞内产生活性氧而增加。通过PERPP 控制ApoB100 分泌，是血浆中ApoB 水平正常和病理调节的关键组成部分，也是一种显著的分泌蛋白后期质量控制手段[25]。

ApoB100 的降解是肝细胞可分泌VLDL 颗粒数量的主要决定因素，也是肝脏净TG 产生的调节因子。完成ApoB100降解的方式较多，可表明ApoB100在VLDL组装和分泌中的重要性以及肝细胞对各种代谢状态和应激作出反应的灵活性。ApoB100 降解速率的变化是各种代谢扰动后，含ApoB100和ApoB100脂蛋白肝脏分泌差异的潜在解释，确定每种已知的ApoB100降解途径对其体外净分泌调控的定量影响非常重要。通常情况下，每个途径的作用均孤立于其他途径。

2.4 ApoB100在肝脏中的自噬作用

自噬是介导ApoB100 降解的一种诱导形式。自噬在参与维持脂质稳态的主要器官肝脏和脂肪组织中调节脂质储存，在调节肝脏脂质稳态和VLDL分泌中发挥多种作用。肝细胞中，自噬作用的关键是胞质脂滴的分解，此过程被称为脂噬；与之相反，脂肪细胞分化和脂滴的同时积累需要自噬。

自噬还可通过促进脂蛋白组装影响脂质代谢。目前已有许多研究表明，ApoB100 的降解过程中存在自噬现象；如对大鼠肝癌细胞的研究发现，通过敲低ATG7表达或使用3-MA 过表达抑制自噬体组装，可缓解细胞内ApoB100 的降解[26]；Sun 等[27]通过过表达PCSK9，表明PCSK9 与ApoB 相互作用，通过影响自噬抑制ApoB 的降解途径，进而调节ApoB的分泌。

异常自噬可能与代谢紊乱（如代谢综合征）中脂质稳态失调有关。胰岛素信号和自噬活性在相互调节机制中出现分歧，提示自噬在胰岛素抵抗中发挥作用；上调自噬可能导致白色脂肪组织向棕色脂肪组织转化，从而调节能量消耗和肥胖。此外，上调肝细胞自噬可增加脂质储存的破坏，控制TG稳态和脂肪肝[28]。

自噬或PERPP 可视为1 种通过破坏ApoB100 从而调节其水平的控制途径，以避免肝细胞出现ApoB100 和VLDL 颗粒积累；若颗粒太大而无法由内质网相关降解途径处理，需要从内质网逆向易位并由蛋白酶体降解。因此，增加自噬是一种保护性的、稳态的反应。由此可见，自噬在脂质稳态中发挥非常复杂的作用，根据不同组织影响脂质储存并参与脂蛋白的代谢途径[29]。

3 ApoB100在兽医临床中的相关研究

ApoB100的合成分泌受到代谢影响，自然发生和乙硫氨酸诱发的脂肪肝血清中ApoB100浓度降低。因此，脂肪肝是奶牛血清ApoB水平降低的主要原因。ApoB100受体结合区的基因结构及其突变情况可为揭示围产期奶牛脂肪肝和酮病的发病机制提供参考，同时为奶牛脂肪肝的基因治疗提供参考。

ApoB100作为VLDL 的结构蛋白和主要的载脂蛋白，其主要功能是参与VLDL和LDL的组装和分泌，而预防或治疗脂肪肝的方法之一是增加VLDL 从肝脏输出的速率[30]。ApoB100 的降解是肝细胞可分泌VLDL 颗粒数量的主要决定因素。随着越来越多小鼠模型建立，上述降解通路通过基因操作而减弱或过度活跃，在体内测试其对肝脏ApoB100 产生的影响将是细胞培养研究和治疗奶牛脂肪肝的重要联系。Zhou等[31]采用油酸诱导肝细胞、果糖诱导小鼠肝脂肪变性，结果发现，GF-Ala 能够显著抑制ApoB100 的翻译后降解，改善肝脏脂质积累，减少脂质过氧化，促进肝细胞TG 转运。研究表明，GF-Ala 可能是治疗脂肪肝的潜在药物。