Wnt信号通路在骨稳态中的作用

杨洲 高静媛 田发明

1.华北理工大学研究生学院，河北 唐山 063000 2.华北理工大学附属医院全科医学科，河北 唐山 063000 3.华北理工大学医学实验中心，河北 唐山 063000

骨稳态是由骨形成和骨吸收活动组成的动态平衡过程，调控骨稳态的细胞群被称为基本多细胞单位(basic multicelluler unit，BMU)[1]。BMU主要由处于不同分化阶段的成骨细胞谱系和破骨细胞谱系的细胞组成[2]。成骨细胞系衍生自骨髓间充质干细胞，破骨细胞系衍生自造血干细胞。在病理条件下，骨稳态被破坏，高破骨细胞活性或低成骨细胞活性导致低骨量表型，而低破骨细胞活性或高成骨细胞活性导致高骨量表型[3]。Wnt信号通路是调节骨稳态的关键信号通路之一[4]，但其Wnt配体具有多样性，且成骨细胞、骨细胞、软骨细胞和骨髓间充质干细胞分泌的Wnt配体亚型不尽相同，明确Wnt信号通路对上述细胞功能调控及其在调节骨骼发育和体内平衡中的作用，有望为相关骨骼疾病的防治提供新的思路和靶点。

1 Wnt/β-catenin信号通路概述

Wnt蛋白家族有19种分泌型糖蛋白，可以根据是否依赖β-catenin大致分为经典和非经典的Wnt信号通路。Wnt信号通路在多种细胞活动中发挥重要作用，包括细胞增殖、分化、迁移、极性和基因表达[5]。

经典的Wnt途径，即β-catenin依赖途径，它是由经典的Wnt配体(Wnt3a、Wnt1、Wnt7b)与Frizzled受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(low density lipoprotein receptor-related protein，LRP)结合导致胞内β-catenin积聚，当β-catenin积聚到一定量时就会转位到细胞核与转录因子T细胞因子/淋巴增强因子结合因子(TCF/Lef)位点结合，从而激活下游的靶基因表达[6]。Wnt信号通路还受到抑制剂的调节，如分泌性型卷曲相关蛋白(secreted frizzled-related proteins，SFRPs)、DKK(Dickkopf)和骨硬化蛋白(sclerostin，SOST)。基于大量体外和体内研究的证据表明，经典的Wnt途径对于骨量的增加和维持具有重要作用[7]。

与依赖β-catenin的经典Wnt通路相比，非经典Wnt信号通路能够激活独立于β-catenin的信号通路，在一些情况下还可以抑制路经典的Wnt途径。非经典Wnt信号通路进一步被分为平面细胞极性(PCP)通路和Wnt/Ca2+通路。最近越来越多的研究表明，非经典的Wnt信号在成骨细胞分化和骨形成中起重要作用。在Wnt/Ca2+通路中，有研究证明非经典的Wnt5A配体诱导CaMKII-TAK1-TAB2-NLK信号，通过染色质失活在转录水平上抑制PPARc反式激活，并诱导Runx2表达，从而抑制小鼠基质细胞ST2的脂肪生成而促进成骨细胞分化[8]。在PCP通路中，有研究证明JNK信号通路在人和大鼠骨髓间充质干细胞中都被认为具有促进成骨细胞分化和抑制脂肪细胞分化的作用[9]。

2 人类骨骼疾病中的Wnt/β-catenin信号通路

1994年Liu[10]等首次发现Wnt信号通路与骨骼发育有关，即全身敲除Wnt3a的小鼠胚胎表现出前后轴向发育的缺陷。骨质疏松-假性神经胶质瘤综合征(OPPG)是一种与骨量急剧减少相关的罕见综合征，有文献报道在OPPG的患者中检测到LRP5基因的纯合突变(例如R428X、E485X、D490fs)[11]。该基因的错义突变抑制了两种内源性的Wnt配体拮抗剂DKK和SOST与LRP5的结合，从而激活了Wnt信号通路的表达。随后的研究也证明了LRP5/6和其他Wnt信号传导成分的错义突变都会影响骨量和骨强度。例如，在家族性骨质疏松症和早发性冠状动脉疾病的患者中检测到了LRP6基因的杂合突变，早发性骨质疏松症患者发生了Wnt1基因的杂合突变，成骨不全症(osteogenesis imperfecta，OI)患者发生了Wnt1基因的纯合突变[12]。此外，SFRP4的纯合突变也会引起Pyle病，其特征是肢体畸形、皮质骨变薄和骨折[13]。除上述罕见突变外，CTNNB1、WLS、SOST、WNT4和WNT16位点中与BMD相关的单核苷酸多态性(SNP)也与骨折风险略有增加相关[14]。因此，上述Wnt/β-catenin信号分子中的罕见突变和常见变异都导致了低骨量表型及骨质量下降，提示对Wnt/β-catenin信号通路相关的关键基因的干预可用于相关骨骼疾病的治疗。

此外，Wnt信号通路中不同基因的突变除了会导致人类骨骼疾病的低骨量表型也可导致高骨量表型。例如，SOST基因突变可引起骨硬缩症和Van Buchem病，表现出高骨量相关的骨表型。SOST是内源性的Wnt/β-catenin信号通路的拮抗剂，可与LRP5和LRP6结合，进而阻止LRP5/6与Wnt配体的结合导致Wnt/β-catenin途径被抑制[15]。最近有研究明确表明，LRP5/6与SOST的相互作用在生理和病理条件下的骨稳态中发挥重要作用[16]。

3 利用转基因小鼠模型评估Wnt/β-catenin在骨稳态中的作用

为明确Wnt信号通路调控骨稳态的细胞和分子基础，目前已有研究构建了多种转基因小鼠模型，即通过具有β-catenin(由Ctnnb1基因编码)、Wnt配体和Wnt受体基因修饰的转基因小鼠来评估Wnt信号通路在骨稳态中的作用。

3.1 β-catenin

遗传学研究通过在成骨细胞发育的不同阶段条件下敲除β-catenin，提示WNT/β-catenin信号通路对骨稳态的影响在细胞的发育阶段起作用。例如，在成骨细胞分化的早期阶段，靶向敲除MSCs中的β-catenin小鼠通过下调与成骨分化相关的转录因子Osterix的表达，抑制成骨细胞分化进而导致骨量下降[17]。成骨前体细胞靶向敲除β-catenin小鼠，分化成熟的成骨细胞活性丧失，同时促进破骨细胞和骨髓脂肪形成进而导致骨量下降[18]。成熟成骨细胞或骨细胞中β-catenin的条件性敲除间接增加了破骨细胞的数量和活性，但对成骨细胞没有显着影响，而在相同条件下结构性激活β-catenin会显著增加骨沉积，减少破骨细胞的形成[19]，并且组织学分析也表明这些突变主要影响骨吸收而不是骨形成。为了进一步阐明β-catenin对破骨细胞的具体作用，有研究证明破骨细胞中β-catenin的组成性活化小鼠，促进破骨细胞生成，骨吸收增加进而导致低骨量表型[20]。这些发现表明β-catenin信号在出生后骨稳态中起重要作用。

3.2 Wnt配体

Wnt蛋白是一种富含半胱氨酸的高度疏水性蛋白，需要进行脂质修饰来促进其分泌。Wnt蛋白的脂质修饰由Porcn蛋白处理，Porcn蛋白是定位于内质网的膜结合O酰基转移酶(MBOAT)家族中的成员，是一种多次跨膜蛋白。脂质修饰后的Wnt蛋白由另一种位于内质网的Wntless/GPR177蛋白识别，随后Wnt配体被到运输到细胞表面分泌[21-22]。

已经有研究利用Porcn或Wntless来解决Wnt配体家族介导骨发育或骨稳态过程的相关问题。当GPR177在成熟的成骨细胞靶向敲除时，小鼠骨量降低，证明了Wnt配体在调节出生后骨骼发育中发挥关键作用。此外，当在成骨细胞和软骨细胞靶向敲除GPR177时，软骨发育受到影响，出现更严重的骨表型[23]。因此仍然需要进行大量研究证明不同组织来源的Wnt配体在骨稳态的作用，并且需要找到一种区分经典或非经典的Wnt配体的在骨稳态中作用的方法。

3.2.1经典Wnt配体：在经典的Wnt配体中，Wnt7b和Wnt10b的研究较为广泛。在骨祖细胞中条件性的敲除Wnt7b会导致骨化延迟[24]，而在成熟的成骨细胞靶向激活Wnt7b的表达，表现出高骨量表型，该表型始于晚期胚胎，并在出生后加剧[25]。这项研究证明Wnt7b主要通过刺激成骨细胞数量和活性来增加骨量，对破骨细胞活性没有显著作用。在骨髓中过表达Wnt10b的转基因小鼠成骨细胞分化相关的转录因子Runx2、Dlx5和Osterix表达上调表现出高骨量表型，而在相同条件下敲除Wnt10b的小鼠骨小梁和血清的骨钙素减少，从而证实Wnt10b是骨形成的内源性调节剂[26]。为了进一步研究Wnt10b在骨稳态中的作用，在成熟成骨细胞过表达Wnt10b小鼠，同样表现出高骨量表型，在该动物模型中，Wnt10b主要通过刺激成骨细胞生成来增加骨量，并未对破骨细胞产生影响[27]。因此，笔者推测Wnt10b主要是通过促进成骨细胞分化来调节骨稳态。此外，最近的研究结果显示，WNT1突变与某些类型的成骨不全症有关，强调了Wnt1在正常的骨骼发育和稳态的重要性[28]。建立全身或靶向MSCs的Wnt1敲除小鼠，成骨细胞分化能力下降，表现出低骨量表型，模仿了人类WNT1纯合突变的OI表型[29]。在骨细胞中靶向敲除Wnt1同样也表现出了低骨量表型，出现自发性骨折与OI患者相似，而在骨细胞中过表达Wnt1通过增加成骨细胞数量和活性刺激骨形成，此作用部分归因于mTORC1信号的激活[30]。因此，笔者推测Wnt1主要是通过调节成骨细胞功能而有助于骨稳态。因为已知在骨稳态中的表达多个Wnt和FZD，很可能功能冗余掩盖了这些因子在体内的相对重要性。Porcn和GPR177基因是Wnt生产细胞分泌Wnt配体的特有基因，可能有助于解决这些问题。

3.2.2非经典WNT配体：在非经典的Wnt中，Wnt5a的研究最为广泛，在胚胎骨骼发育中起着至关重要的作用，Wnt5a与受体酪氨酸激酶样孤儿受体(Ror)1/2结合，以激活非经典的Wnt信号通路，包括Ca2+、蛋白激酶C激活和平面细胞极性(PCP)途径激活[31]。Oishi等[32]研究发现，与敲除Fzs基因的小鼠相比，Ror2基因敲除小鼠与Wnt5a基因敲除小鼠的表型更为相似，都表现为身材矮小、颜面畸形、四肢和尾巴短小以及呼吸功能障碍。Wnt5a基因敲除小鼠表现出骨形成减少，脂肪生成增强，骨生成受损。因此，Wnt5a信号的特异性激活在骨形成中发挥了关键的作用。最近，显示成骨细胞衍生的Wnt5a增强破骨细胞生成通过在破骨细胞前体的表面上结合Ror2来激活Jun N末端激酶(JNK)，然后增加核因子κβ(RANK)表达的受体激活剂。但是，Wnt5a可能以依赖单元上下文的方式发挥其作用[33]。此外，Wnt16基因敲除小鼠的骨皮质厚度显着降低，增加了骨折易感性[34]。Wnt16主要由成骨细胞谱系产生，在皮质骨的骨稳态中发挥重要作用，其作用机理是直接作用于破骨细胞祖细胞，而间接地通过增加成骨细胞中骨保护素(Opg)的表达来抑制人和小鼠的破骨细胞生成[34]。但是还是需要做更多的工作以评估其下游途径介导这些效应。因此，Wnt配体与骨细胞代谢之间的联系已逐步确认并成为本领域研究的热点问题之一。

4 Wnt信号通路在人类骨骼疾病治疗中的前景

基于Wnt/β-catenin信号对骨稳态的调控，该信号通路的关键信号分子或其相应的调节剂已成为开发骨丢失相关疾病治疗药物的新靶点。SOST和DKK1是内源性经典Wnt拮抗剂，可直接抑制成骨细胞生成以及间接促进破骨细胞生成，并分别参与骨质疏松症和癌症相关的骨溶解的发病机制。由于SOST和DKK1是Wnt信号通路作用于骨稳态失衡疾病的合理靶标，有研究证明已开发了抗SOST单克隆抗体(Romosozumab、Blosozumab和BPS804)，抗DKK1单克隆抗体(BHQ880、DKN-01和PF-04840082)和针对SOST和DKK1的双特异性抗体(Hetero-DS)[35]。

Romosozumab是Wnt/β-catenin信号通路中研究最广泛的药物，多项临床三期试验和临床应用已经证实，与安慰组相比，Romosozumab可以显著增加绝经后骨质疏松女性患者骨密度，降低椎体骨折和临床骨折发生率。由于该药物在安全性方面出现了严重心血管不良事件，因此，Romosozumab在日本、欧美仅被批准用于治疗伴有很高的骨折风险，且没有心脏病发作、心肌梗死或中风的病史的严重绝经后骨质疏松症患者中。由于其上市时间较短，Romosozumab治疗骨质疏松症的有效性和安全性还需要进一步的评估。

Blosozumab和BPS804也已经应用于绝经后女性骨质疏松症患者的临床二期试验中。与安慰剂组相比，Blosozumab和BPS804治疗组显著增加了骨密度、骨形成的标志物，同时减少了骨吸收标志物、骨折发生率降低，为后续3期试验铺平了道路。而BHQ880和DKN-01在患有多发性骨髓瘤和其他实体瘤(例如胆管癌、食道癌和胃癌)的患者中也进行了一期临床试验[35]，并显示出良好的抗肿瘤效果。

综上所述，Wnt/β-catenin对成骨细胞和或破骨细胞的功能调控及平衡在骨发育及骨稳态维持中均发挥重要作用，针对该信号通路的相关调控分子或小分子有望作为相关骨骼疾病的治疗药物，但以SOST和DKK1为靶点的小分子药物的安全性、干预节点及使用策略等，尚需更多的临床试验验证和确定。