间充质干细胞源性外泌体在糖尿病性骨质疏松中的研究进展

阮泽松 陈云丰

上海交通大学附属第六人民医院骨科，上海 200233

糖尿病性骨质疏松(diabetic osteoporosis，DO)是糖尿病的常见并发症之一，由糖尿病相关的血糖调节受损、微血管损伤、晚期糖基化终末产物堆积等病理因素导致[1-2]，主要表现为骨量减少、骨脆性增加、骨折风险增加。目前常规用来治疗骨质疏松的药物对糖尿病性骨质疏松疗效有限[3]，存在增加非典型性骨折发生的风险[4]，如何安全有效地进行糖尿病性骨质疏松治疗成为亟待解决的难题。

近年来，许多研究报道了关于运用间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)治疗骨质疏松的潜在疗效。MSCs来源广泛，在体内体外均能诱导成骨分化[5]，此外，诸如改善胰岛素抵抗、促进微血管的生长等特性在治疗糖尿病性骨质疏松拥有巨大前景[6]。但干细胞疗法存在诸如免疫排斥、恶变等安全问题与伦理道德问题[7]，阻碍其在临床治疗中的发展与运用。

间充质干细胞源性外泌体(mesenchymal stem cell-derived exosomes，MSC-Exos)是MSCs旁分泌形成的一类胞外囊泡，介导MSCs在多种疾病中的治疗作用[8-9]。应用MSC-Exos治疗骨质疏松也具有一定疗效[10-12]，且能够避免免疫排斥等风险[13]，有望发展成为一种医治糖尿病性骨质疏松的新手段。本文综述了MSC-Exos与糖尿病性骨质疏松相关研究，探求将MSC-Exos应用于治疗糖尿病性骨质疏松的治疗机制。

1 MSC-Exos的一般特性

外泌体是一类由脂质双分子层包含多种蛋白质、脂肪、核酸形成的胞外囊泡。其中，蛋白质可分为膜蛋白和囊内蛋白，分别参与细胞的识别与外泌体的释放过程[14]。脂肪酸、胆固醇、鞘磷脂、鞘糖脂等脂质能增强外泌体的稳定性，促进外泌体的出芽释放[15]。核酸如DNA、miRNA能在外泌体保护不被降解，确保在受体细胞中参与基因转录及翻译水平的调节[16]。外泌体通过其包含的蛋白质、核酸等生物活性物质介导细胞间通讯，参与体内组织修复、免疫调节、血管生成、肿瘤转移等多种病理生理过程[17]。

最初认为MSCs在治疗中发挥的作用是通过增殖并分化成为效应细胞产生，然而最近诸多研究表明MSCs通过其旁分泌产生的外泌体发挥治疗效果。最早由Lai等[18]在2010年首次发现了MSC-Exos对小鼠心肌缺血再灌注损伤的修复作用，随后陆续揭示了MSC-Exos在肺、肝等疾病中的治疗作用[8-9]。其中，也有相关研究指出MSC-Exos对骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨功能具有促进作用，有效改善骨质疏松小鼠骨量情况[19]，是潜在的骨代谢疾病治疗方法。

2 糖尿病性骨质疏松的发病机制

糖尿病性骨质疏松主要表现为继发于糖尿病后出现的骨量降低、骨脆性增加、骨折风险增加，主要涉及以下机制：(1)高血糖水平使得正常骨组织的生长代谢受到影响。其中BMSCs由于凋亡增加导致数量明显减少，并且其分化为成骨细胞的能力减弱，导致了“成骨”与“破骨”之间的平衡被破坏。此外，糖尿病患者体内高糖环境诱导BMSCs趋向脂肪细胞分化，导致髓腔内脂肪堆积，进一步抑制了成骨分化[20]。(2)糖尿病的微血管病变导致骨的血供受限，降低了成骨龛的氧气以及营养供应，骨组织的正常代谢受到影响。同时由于局部缺氧，髓腔内氧化应激水平增加，影响血管内皮细胞的分化，使得原本供氧不足的骨组织病情加重[21]。(3)晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)是在糖尿病患者体内由胶原蛋白的氨基酸残基与高浓度糖通过非酶促糖化形成的一类有害代谢物质。AGEs在骨组织中的积累会影响骨骼的结构特性，使得骨脆性增加。AGEs还会引起局部炎症水平增加诱导成骨细胞凋亡，影响骨形成[22-23]。(4)胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗可引起骨组织能力代谢障碍，导致成骨减少[24]；一些治疗糖尿病的药物对骨形成的过程也会产生不利影响[25]。此外，其他并发症如糖尿病肾病导致血钙、维生素D水平降低，将加重骨质疏松水平[26]。

3 MSC-Exos对糖尿病性骨质疏松的治疗机制

3.1 MSC-Exos参与调节BMSCs成骨分化

如何实现促进BMSCs向成骨分化是恢复正常骨组织密度的核心问题，在这过程中MSC-Exos可通过以下途径发挥作用。

3.1.1MSC-Exos能够促进骨髓间充质干细胞增殖，抑制其凋亡：Yang等[27]评估脐带源性间充质干细胞外泌体对BMSCs的保护作用时，发现来自外泌体的miRNA-1263抑制了受体细胞中Mob1蛋白的活性并激活Hippo通路中的效应蛋白YAP，从而实现对BMSCs的保护。Zhu等[28]在体外模拟高浓度葡萄糖条件下进行实验，验证了在模拟高血糖状态下MSC-Exos对BMSCs的增殖也具有促进作用。

3.1.2MSC-Exos能够促进BMSCs向成骨分化：成骨细胞具有合成、分泌矿化骨基质的功能，其生成受损是骨质疏松致病过程的关键。Qi等[29]利用人源性多能干细胞衍生的间充质干细胞(hiPSC-MSC)产生的外泌体处理BMSCs，发现细胞中RUNX-2、COL1和ALP等成骨相关蛋白的表达增强，体外成骨实验如ALP染色与茜素红染色结果也显示骨形成增强。越来越多的研究表明这一诱导成骨的效应可能是通过外泌体中的miRNA介导。Qin等[10]证实BMSC源性外泌体中miRNA-196a、miRNA-27a和miRNA-206促进BMSC向成骨分化，同时也发现了除这三类microRNA之外，外泌体中还存在其他影响BMSC成骨分化的成分。

3.1.3MSC-Exos能抑制BMSCs向脂肪细胞的分化：MSCs在糖尿病患者体内趋向脂肪细胞分化并出现骨髓脂肪堆积，增加的脂肪细胞上调PPARγ、CEBPα和CEBPδ等基因的表达，进一步影响BMSCs的分化以及抑制成骨细胞的成骨作用[30-31]。可见，有效地抑制BMSCs脂肪分化能够恢复正常的成骨水平。有研究报道BMSC源性外泌体中的miRNA126-3p可降低BMSCs中FTO蛋白的活性，抑制其分化为脂肪细胞。此外，miRNA126-3p还通过抑制MYC/PI3K/AKT信号通路，促进BMSCs的成骨分化[32-33]。

3.2 MSC-Exos对成骨细胞和破骨细胞的影响

成骨细胞与破骨细胞之间相互作用以促进正常骨生长及维持合理骨密度，但这种平衡状态在糖尿病性骨质疏松中被打破。MSC-Exos除影响BMSCs的分化外，还可通过调节“成骨”与“破骨”的水平来参与骨代谢。Yang等[34]研究表明来自BMSC源性外泌体中的lncRNA-MALAT1进入成骨细胞后与胞内miRNA-34c结合，增加STAB2的表达并增强两个转录因子Runx2、ATF4的活性，促进成骨作用。MALAT1也可通过抑制miR-22-5p促进RANKL介导的破骨细胞溶骨作用[35]，但是整体来看，经MSC-Exos治疗的骨质疏松动物模型表现为骨量增加，骨质疏松缓解[34]。其他的研究表明MSC-Exos对破骨细胞活动的调节存在争议，Hu等[36]研究脐带间充质源性外泌体对骨质疏松小鼠的保护作用时，发现外泌体中的CLEC11A通过抑制RANKL的表达从而表现出对破骨细胞骨吸收的抑制作用。Chen等[11]研究经尿源性间充质干细胞外泌体治疗后的骨质疏松小鼠的骨代谢水平，通过qPCR发现成骨相关基因如Ocn、Alp和Runx2的mRNA含量增加明显；而破骨细胞相关基因如Trap、Mmp9、Ctsk受到了抑制，证实了外泌体中CTHRC1和OPG产生的促成骨和抗破骨作用。

在这些研究中，不同来源的MSC-Exos都促进了成骨细胞的骨形成作用，然而对于破骨细胞的作用尚无确定结论。因此仍需进一步比较不同来源的MSC-Exos的作用，并筛选出能高效治疗糖尿病性骨质疏松的类型。

3.3 MSC-Exos改善骨组织的血供

正常情况下骨的血供满足组织必需的氧气和营养物质并提供激素、生长因子等刺激骨的生长。而在糖尿病的病理条件下，血供受损无法维持骨组织正常的生长代谢[21]。而MSC-Exos携带的物质能够通过参与多种信号通路影响血管生成，改善血供不足的情况。血管内皮生长因子(VEGF)是一类通过趋化内皮细胞实现耦合骨与血管生长的蛋白[37]。MSC-Exos包含有VEGF以及促进靶细胞VEGF表达的多种物质，通过激活靶细胞的PIK3/AKT/mTOR通路以及抑制PTEN的表达，通过促进内皮细胞增殖和血管生成来提高成骨水平[38-39]。除VEGF通路外，MSC-Exos也可通过NOTCH通路对内皮细胞产生类似的作用[40]。Gonzalez-King等[41]对过表达HIF-1的MSC-Exos进行研究，发现NOTCH通路配体Jagged1与内皮细胞上的受体结合后能促进胞内NICD形成，影响靶基因如HES1、HEY2的表达，使得内皮细胞血管网的形成增加。

除诱导血管生成外，MSC-Exos还能够改善AGEs诱导的微血管病变。糖尿病引起的血管钙化是发生骨质疏松的风险因素[42]。Wang等[43]在模拟的糖尿病环境下发现BMSCs产生的外泌体中miRNA146a含量增加，通过减少TXNIP基因在血管平滑肌组织中的表达，抑制了血管平滑肌钙化。应用MSC-Exos治疗能有效促进血管生成和改善血管的顺应性，恢复骨骼正常的血液供应，促进骨形成。

3.4 MSC-Exos对糖尿病及其并发症的作用

针对糖尿病的病理机制，选择合适的治疗和预防手段能有效提高糖尿病性骨质疏松的治疗效果。Sun等[44]研究结果表明MSC-Exos能够协同胰岛素激活AKT、IRS-1信号通路改善胰岛素抵抗，增加靶组织GLUT2、GLUT4的表达以促进对葡萄糖的摄取及利用。Exos还能够缓解链脲佐菌素(STZ)诱导的胰岛β细胞损害，通过恢复胰岛素受体底物1和蛋白激酶B的磷酸化改善胰岛素分泌并维持血糖稳定，加强肝糖原的储存以减少AGEs的产生与蓄积。可见MSC-Exos恢复组织对葡萄糖的利用这一特性可能成为其治疗糖尿病性骨质疏松的潜在机制。

糖尿病肾病是最常见的糖尿病并发症。肾脏的病变导致尿蛋白丢失增加，血钙、维生素D水平降低[26]。因此改善糖尿病的肾损害，维持血钙、维生素D正常水平也是治疗糖尿病性骨质疏松的重要部分。Jin等[45]发现MSC-Exos中的miRNA-486可降低足细胞中Smad1蛋白表达，通过抑制mTOR的磷酸化来下调足细胞的凋亡水平，有效缓解了糖尿病肾病的进程。此外，MSC-Exos在对诸如糖尿病足、周围神经病变、视网膜病变等其他糖尿病并发症也具有一定的治疗作用[46-48]。可见应用MSC-Exos能够兼顾对原发病及其他继发疾病的治疗，以有望切实提高治疗糖尿病性骨质疏松的效果。

4 MSC-Exos临床的应用展望

糖尿病及其相应的并发症如糖尿病性骨质疏松俨然已成为现代社会严重的健康问题，亟待有效解决。应用MSC-Exos治疗糖尿病性骨质疏松切合其发病机制，在细胞实验、动物模型上具有一定效果。但是将其真正运用于临床还需解决许多问题：(1)MSC-Exos治疗糖尿病性骨质疏松的具体机制并不完全明确。现有的研究表明多种miRNA与蛋白质参与疾病的治疗。此外，不同组织来源的MSC-Exos对糖尿病性骨质疏松的治疗机制和治疗效果存在差异，有待进一步研究以明确应用于疾病治疗的最佳MSC-Exos来源。(2)将MSC-Exos通过静脉注射后会在肝、肺等组织富集[49]，无法靶向到损伤部位。将MSC-Exos掺入β-TCP支架中可直接在骨缺损部位发挥疗效[29]，后续可通过寻找契合MSC-Exos生物活性功能的可降解生物支架材料以最大化其治疗效果。(3)MSC-Exos能够高效介导细胞间通讯，可作为治疗用蛋白、核酸的输送载体，通过调节对应信号通路发挥治疗作用[41]。利用这一特性，可设计运载特定生物活性分子以实现对糖尿病性骨质疏松的治疗效果。若能修饰其表面蛋白，将MSC-Exos高效地靶向对应病变组织，可明显减少不良反应并提升疗效。

MSC-Exos的优秀特性为治疗糖尿病性骨质疏松提供了新的方向。随着MSC-Exos相关研究不断发展，对其认识更加明确，MSC-Exos将成为治疗糖尿病性骨质疏松有效的新方案。