经典Wnt信号通路与肿瘤免疫耐受的研究进展

霍迪妮，聂小博

(河南大学基础医学院，河南 开封 475004)

经典Wnt(整合酶基因与无翅基因)信号通路又称为Wnt/β联蛋白信号通路，在进化过程中高度保守，通过调控细胞的增殖、分化、凋亡等过程在胚胎发育、组织稳态和组织修复过程中发挥重要作用[1]。经典Wnt信号通路转导异常与诸多疾病的发生和发展有密切关系，其中与恶性肿瘤的关系一直是肿瘤学研究领域的热点方向。经典Wnt信号通路中关键组成分子发生基因突变或表观遗传学修饰均会导致其信号转导失调，进而促进恶性肿瘤的发生、进展、耐药及复发。近年来，随着肿瘤免疫学的兴起，其在肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)中的调节作用也引起了人们的日益关注。经典Wnt信号通路已被证明通过调控树突状细胞、T细胞和肿瘤细胞等参与癌症免疫周期的各个阶段[2]。虽然免疫治疗尤其是免疫检查点阻断疗法已在恶性肿瘤治疗中取得了很好的效果，但部分患者对于免疫治疗的初始反应低下或长期治疗后产生耐药，这均与经典Wnt信号通路异常有一定关系[3]。因此，联合应用Wnt调节剂有望改善TME，增强免疫治疗的效果。 现就经典Wnt信号通路与肿瘤免疫耐受的研究进展予以综述。

1 经典Wnt信号通路的转导机制

目前在人类中已鉴定出19种Wnt蛋白分子[4]。Wnt蛋白在出细胞前必须经过棕榈酰化修饰，此过程依赖酰基转移酶Porcupine(PORCN)的作用[5]。Wnt蛋白以自分泌或旁分泌方式与靶细胞膜表面的Frizzled(G蛋白偶联受体家族成员)受体以及辅助受体低密度脂蛋白受体相关蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein,LRP)5/6结合。其中Frizzled受体胞外半胱氨酸结构域的N端是Wnt 蛋白的主要结合部位[6-7]。Wnt与Frizzled和LRP5/6结合后形成的复合物会募集细胞质中的Dishevelled蛋白(一种大多数Wnt通路介质)[8]，并通过Dishevelled蛋白特殊的结构域招募轴蛋白并激活轴蛋白-糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3)复合物，促进GSK-3对LRP6的磷酸化修饰[9]，进而抑制由轴蛋白、结肠腺瘤性息肉病(adenomatous polyosis coli，APC)蛋白、GSK-3β和酪蛋白激酶1α等组成的降解复合体的活性，导致β联蛋白在细胞质中蓄积并进入细胞核与转录因子T细胞因子(T cell factor，TCF)/淋巴增强因子结合，激活一系列与细胞增殖、分化等过程相关的靶基因转录[10]。当Wnt蛋白缺乏时，胞质中游离的β联蛋白会被降解复合体中的激酶磷酸化修饰，并通过这些磷酸化位点与E3泛素蛋白连接酶亚基即β-转导素重复序列包含蛋白结合，进而被蛋白酶体降解[11]，此时下游靶基因的转录受到抑制。

2 经典Wnt信号通路转导异常与恶性肿瘤的发生

经典Wnt信号通路中起抑制作用的组分发生失活性突变或起信号转导作用的组分发生激活性突变均会导致该通路的异常激活，促进恶性肿瘤的发生和发展。APC蛋白和轴蛋白是降解复合体中的关键组分[12]，其编码基因的失活性突变会导致β联蛋白的过度蓄积及下游癌基因的过度转录，诱导正常细胞的恶性转化或肿瘤细胞的恶性增殖[13]。在大多数结直肠癌组织中可以检测到APC基因的失活性突变，且这些突变在结直肠癌早期已经发生[14]，然而目前尚不清楚这些突变发生的原因。此外，在部分肝细胞癌及肝母细胞瘤组织中可以检测到Axin 1和Axin 2基因的失活性突变[15]。基于人类癌症基因组数据库的一项研究发现，子宫内膜癌、肝癌和结直肠癌组织中β联蛋白编码基因的激活性突变发生率均较高，且突变主要发生在编码N端区域的第3个外显子附近[16]，然而该基因突变的频率在其他类型的恶性肿瘤中很低。恶性肿瘤的发生和进展也与经典Wnt信号通路中关键组分或其调控分子编码基因的DNA甲基化或共价组蛋白修饰等表观遗传学改变导致的信号转导异常有关[17]。例如，分泌型脆性相关蛋白1和β联蛋白抑制基因3均是经典Wnt信号通路的抑制性调控因子，前者基因启动子区域的高甲基化会导致其表达水平降低，失去对Wnt蛋白的抑制作用，促进非小细胞肺癌细胞的恶性增殖[18]。β联蛋白抑制基因3的二价组蛋白修饰也会降低其表达水平，失去对β联蛋白和经典Wnt信号通路的抑制作用。在结直肠癌组织中可以检测到β联蛋白抑制基因3二价组蛋白修饰水平的升高及表达水平的明显降低[19]。因此，阐明经典Wnt信号通路转导异常发生的分子机制对于恶性肿瘤的靶向治疗具有重要意义。

3 经典Wnt信号通路异常与免疫监测的破坏

经典Wnt信号通路不仅能够调控造血干细胞的自我更新和祖细胞的增殖，还可以调控胸腺T细胞的发育过程[20]。此外，经典Wnt信号通路的激活有利于记忆性CD8+T细胞的生成，强化免疫系统对抗病原体的能力[21]，这对于维持免疫系统稳态至关重要。然而，经典Wnt信号通路异常激活会通过调节免疫细胞参与肿瘤免疫，协助肿瘤细胞逃避免疫监视，并引起肿瘤对免疫治疗产生耐药。

3.1经典Wnt信号通路异常促进免疫耐受 TME是指肿瘤细胞生成和生活的微环境。肿瘤细胞与TME之间复杂的相互作用对于肿瘤的发展、转移以及治疗反应至关重要。TME中除了含有肿瘤细胞，还包括其他类型的细胞，如成纤维细胞、免疫细胞和脂肪细胞等，以及肿瘤血管、淋巴管和细胞外基质成分，同时还存在一些细胞因子、生长因子和趋化因子[22]。免疫耐受是肿瘤细胞逃避免疫监视的主要方式。经典Wnt信号通路异常激活会在一定程度上影响TME中树突状细胞的成熟与激活。有研究表明，β联蛋白缺失会导致树突状细胞表面共刺激分子表达水平增加以及共抑制分子表达水平降低，增强抗肿瘤免疫[23]。相反，激活TME中树突状细胞的β联蛋白会诱导免疫调节因子的产生，促进调节性T细胞(regulatory T cell，Treg细胞)的分化，介导免疫抑制；同时通过抑制炎症细胞因子的产生抑制效应T细胞的分化，促进免疫耐受[24]。其中，树突状细胞中的免疫调节因子视黄酸由维生素A代谢而来，肿瘤细胞会激活树突状细胞中的β联蛋白，β联蛋白与TCF4结合后会诱导维生素A代谢酶的表达，在该酶作用下生成的视黄酸能够驱动Treg细胞的分化并限制效应T细胞[23]。同样，免疫调节酶吲哚胺2，3-双加氧酶-1也会促进树突状细胞的耐受及Treg细胞的发育。有研究发现，黑色素瘤来源的Wnt5a依赖于β联蛋白的作用诱导树突状细胞中吲哚胺2，3-双加氧酶的表达[25]。此外，树突状细胞中的β联蛋白的激活会促进哺乳动物雷帕霉素靶向蛋白依赖的白细胞介素-10产生，抑制CD8+T细胞的交叉启动。树突状细胞中β联蛋白的激活对于维持克隆扩增的CD8+T细胞也具有重要意义，说明β联蛋白对处于不同发育阶段的CD8+T细胞有不同的调节作用[26]。

3.2经典Wnt信号通路异常抑制T细胞的浸润 TME会降低细胞毒性T淋巴细胞的浸润，这也是肿瘤细胞逃逸免疫监视的机制之一。β联蛋白信号活化能够通过诱导转录激活因子3的表达干扰CC趋化因子配体[chemokine (C-C motif) ligand,CCL]4的生成，抑制CD103+树突状细胞的浸润[27]。而CD103+树突状细胞会产生CXC趋化因子配体[chemokine (C-X-C motif) ligand，CXCL]9和CXCL10，这对于TME招募CD8+效应T细胞是必需的[28]。有研究发现，β联蛋白对于CXCL9和CXCL10的表达也具有调节作用，β联蛋白反应转录抑制因子14是一种β联蛋白/TCF抑制剂，能够上调大肠癌细胞中CXCL9/10/11的表达，促进T细胞浸润[29]。此外，在携带β联蛋白编码基因激活型突变的肝癌中发现，β联蛋白通过下调CCL5的表达导致树突状细胞的募集缺陷，损害T细胞活性，进而抑制机体的抗肿瘤免疫反应并促进免疫逃逸[30]，而TME中CD103+树突状细胞和T细胞的浸润减少正是非T细胞炎症性肿瘤对免疫检查点阻滞和过继性T细胞转移等免疫治疗产生耐药性的主要机制[31]。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4抑制剂和程序性细胞死亡受体1(programmed cell death receptor 1，PD-1)抑制剂/程序性细胞死亡配体1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)抑制剂是目前最主要的两类免疫检查点抑制剂，通过阻断癌细胞表达的免疫检查点与T细胞之间的相互作用抑制免疫耐受及免疫逃避的发生，增强T细胞的活性，使机体产生更加有效的抗肿瘤免疫反应。因此，细胞毒性CD8+T细胞浸润程度越高的恶性肿瘤对免疫检查点阻滞治疗的反应也越强[32]。有研究发现，联合阻断PD-1/PD-L1和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4阴性共刺激通路可以增强B16黑色素瘤TME中CD8+效应T细胞的浸润，使TME向炎症性转变，并减少Treg细胞及髓源性抑制细胞的数量，加强免疫治疗效果[33]。虽然免疫检查点阻断疗法为癌症患者带来新的希望，但目前只有部分患者从中获益，而且某些对治疗有反应的患者也会出现继发性耐药[34]，这些现象已被证明与肿瘤细胞中的β联蛋白信号的过度活化有关[35]。

4 经典Wnt信号通路调节剂在肿瘤免疫治疗中的应用

由于经典Wnt信号通路的异常激活与肿瘤细胞逃避免疫监视密切相关，其靶向药物能够增强肿瘤的免疫治疗。目前靶向经典Wnt信号通路的抑制剂主要有4类：配体受体抑制剂、PORCN抑制剂、端锚聚合酶(tankyrase，TNKS)抑制剂和β联蛋白抑制剂。有研究发现，Wnt3a中和抗体能够促进树突状细胞成熟并诱导肿瘤特异性CD8+T细胞的增殖及抗肿瘤效应，逆转TME中的免疫抑制，恢复免疫监视，进而抑制荷瘤小鼠的肿瘤进展[36]。磷酸源生萘啶是一种新型PORCN抑制剂，通过增加TME中CD8+T细胞浸润抑制肿瘤的进展，但磷酸源生萘啶与DKN-01[一种抗DKK1(Dickkopf-1)抗体]联合应用是否会增强临床前卵巢癌患者对免疫检查点阻滞治疗的反应，仍需要进一步研究[37]。Wnt 974能够抑制Wnt配体的分泌，在体内和体外均可以干扰Wnt信号通路，对小鼠乳腺癌模型和人头颈鳞状细胞癌模型均有显著的抑制作用[38-39]。一项针对晚期实体肿瘤患者的Ⅰ期临床研究发现，Wnt 974还能够增强免疫检查点抑制剂的活性[40]。此外，PORCN抑制剂治疗黑色素瘤荷瘤小鼠能同时增强树突状细胞捕获和交叉呈递肿瘤抗原的能力，并通过调控树突状细胞功能增强肿瘤特异性T细胞的功能[24]。TNKS抑制剂能够抑制细胞中轴蛋白的降解，稳定降解复合体的功能并增强其对β联蛋白的降解作用，抑制经典Wnt信号通路转导[24]。TNKS抑制剂 XAV-939和PORCN抑制剂Wnt-C59均可以降低肿瘤细胞刺激诱导的骨髓源性肌成纤维细胞中PD-L1的表达，进而抑制PD-L1治疗耐药的发生[41]。研究发现，联合应用XAV-939可以增强抗 PD-L1抗体治疗骨髓源性肌成纤维细胞混合瘤的效果，并显著提高TME中CD8+T细胞的比例[41]。另有研究发现，黑色素瘤小鼠接受XAV-939治疗后体内的Treg细胞数量减少，而CD4+T细胞与CD8+T细胞的浸润增加，肿瘤的生长速度受到抑制[23]。另一种新型TNKS抑制剂K-476也被证明通过上调CCL3、CCL4等趋化因子的表达增加CD8+T细胞的浸润，提高免疫检查点抑制剂的疗效，且与XAV-939相比具有更高的选择性和安全性，是一种具有应用前景的新型治疗药物[42]。此外，PKF115-584(一种β联蛋白/TCF4抑制剂)能够抑制小鼠模型中白细胞介素-10的生成，恢复树突状细胞的免疫活性并激活T细胞[43]。因此，联合应用经典Wnt信号通路拮抗剂和免疫检查点抑制剂具有协同作用，能够增强肿瘤免疫治疗的效果。

虽然目前的多数研究认为激活经典Wnt通路可促进肿瘤的恶性进展，但也有研究发现，过表达β联蛋白能够降低肿瘤的自我更新能力，减轻肿瘤负担并提高患者的生存率[44]。目前研究较多的Wnt激动剂包括抗DKK1(经典Wnt信号通路抑制因子)单克隆抗体和GSK-3抑制剂。DKK1通过与LRP5/6结合干扰其正常的信号转导。然而，DKK1会通过靶向抑制β联蛋白诱导髓源性抑制细胞积聚进而抑制T细胞反应，导致免疫抑制性TME的形成[45]。此外，DKK1也会协助潜伏性癌细胞下调自然杀伤细胞激活因子，促进免疫逃逸[46]。相反，中和DKK1能够减少髓源性抑制细胞的数量并通过促进T细胞的募集和激活改善TME的免疫活性，抑制肿瘤的生长[45]。DKN-01是特异性靶向DKK1的人源化IgG4单克隆抗体。目前，单独或联合应用DKN-01治疗晚期难治性胆管癌、晚期食管胃癌以及卵巢癌的相关研究正在进行中[47-49]。在免疫检查点阻滞治疗前使用PORCN抑制剂和DKK1抑制剂能够改善免疫环境，增加卵巢癌对免疫治疗的敏感性[37]。另有研究发现，联合应用mDKN-01(一种新型抗DKK1单克隆抗体)可以增强PD-1抗体对黑色素瘤的治疗效果[50]。GSK-3抑制剂是另一类Wnt激动剂，具有抗肿瘤和促进免疫反应的双重作用。此类抑制剂不仅能够促进自然杀伤细胞的成熟，增强其免疫功能[51]，也可通过激活经典Wnt信号通路促进CD8+记忆干细胞的生成，进而发挥更强的免疫作用[52]。GSK-3的小分子抑制剂已被证明能够降低PD-1的表达，增加CTL的杀伤作用[53]。一项基于小鼠B16黑色素瘤的研究表明，虽然GSK-3抑制剂罗布麻宁的抑癌效果与抗PD-1抗体基本相同[54]，但可以避免低应答率以及耐药性的发生[55]。因此，适度激活经典Wnt通路也有益于肿瘤的免疫治疗。然而针对某种特定类型的恶性肿瘤，选用经典Wnt通路激动剂还是抑制剂才能发挥增强免疫治疗的效果仍需要更多研究才能确定。

5 小 结

异常激活的经典Wnt信号通路通过破坏机体免疫监测，促进肿瘤细胞逃避进而抑制免疫系统的抗肿瘤功能。Wnt通路调节剂已被证明可以增强机体的抗肿瘤免疫能力，其中一些药物甚至可以减少免疫治疗耐药性的发生，增强治疗效果。然而，目前的多数研究结果是基于细胞和动物实验得到的，其临床治疗效果及安全性还需要更多评价，且由于经典Wnt信号通路对于免疫系统的调控过于复杂，选用经典Wnt信号通路激动剂还是抑制剂才能发挥最佳的辅助免疫治疗效果仍需要进一步明确。总之，靶向Wnt信号通路无论是单独应用还是与肿瘤免疫治疗、放疗或化疗等方法联合应用均是颇具应用前景的肿瘤治疗策略。