羟基红花黄色素A对缺血再灌注损伤保护机制的研究进展

汪洁，陈纶华，李涵乔，伊雪

(1.厦门医学院 a.机能与临床转化福建省高校重点实验室,b.基础医学部，福建 厦门 361023； 2.厦门医学院附属第二医院心胸外科，福建 厦门 361021； 3.厦门大学医学院临床医学系,福建 厦门 361102)

红花为菊科植物Carthamus tinctorius L.的干燥管状花，具有通络活血、祛瘀止痛的功效，常用于心脑血管疾病(如高血压、冠心病、脑血栓)的辅助治疗[1]。红花中含有黄酮类、色素、挥发油、脂肪酸等多种化学成分，其中黄酮类化合物红花黄色素是红花的主要有效成分之一，而羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A,HSYA)是红花黄色素中含量最高、活血化瘀最好的水溶性活性单体[2-3]。HSYA为单查尔酮苷类结构，分子式为C27H32O16，分子量为612。HSYA在健康人体的生物半衰期为2.6～4.4 h，1～1.1 h可达吸收峰值[4-5]，人体的健康状态也会影响药物的代谢过程。现代药理学研究表明，HSYA具有扩张微细动脉、增加组织血液灌量、改善微循环的作用，同时能抗血小板聚集、抗凝血、抑制血栓形成，并能调节血脂、清除有害氧自由基，发挥抗氧化作用[6]。近年随着对HSYA研究的深入发现，HSYA具有如下药理学作用：①抗细胞凋亡[7]、促进血管生成[8-9]，发挥保护缺血/缺氧和缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IRI)的作用；②抑制活性氧的产生、增加线粒体膜电位和葡萄糖摄取的能力[10-11]，起到保护线粒体和抗氧化损伤的作用；③调节自噬水平、维持细胞内稳态[12-13]；④促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长[14-15]；⑤改善肺功能[16-17]、保护肝功能[18-19]等。

IRI指缺血组织和器官重新获取血液灌注和氧供后损伤反而加重，甚至发生不可逆性损伤的过程。IRI与组织器官的缺血时间、侧支循环、对氧的需求程度及再灌注条件等密切相关。缺血时间短，恢复血供后，组织或器官的功能多无明显损伤；缺血时间过长，组织或器官已发生不可逆性损伤或坏死，则观察不到IRI。因此，缺血时间太短、太长均不易发生IRI。另外，不易形成侧支循环、需氧量高的组织器官易发生IRI。再灌注液的温度、压力、pH值等也影响IRI。IRI是一个复杂的病理生理过程，目前认为其发生与细胞凋亡、钙超载、氧自由基生成、内皮细胞功能障碍、白细胞激活、能量代谢障碍等因素有关。HSYA在抗IRI方面发挥作用，其对IRI的保护机制与多种途径、信号通路有关，对不同脏器IRI的保护机制也不同，且大部分保护机制尚处于探索阶段。现就HSYA对IRI的保护机制进行综述，以为临床治疗IRI提供理论依据。

1 HSYA对心肌IRI保护机制

1.1激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)/己糖激酶Ⅱ通路 PI3K/Akt是再灌注损伤补救激酶信号通路家族重要成员。PI3K/Akt的激活可有效减少再灌注损伤导致的细胞死亡[20]。己糖激酶Ⅱ是一种糖酵解酶，负责启动无氧葡萄糖代谢。近年来发现己糖激酶Ⅱ在IRI和细胞衰老的发病机制中起重要作用，且Akt激活的己糖激酶Ⅱ可影响线粒体功能、活性氧产生以及线粒体能量代谢，并参与调控细胞凋亡[21]。Min和Wei[22]以H9C2细胞为研究对象，建立缺氧-复氧损伤细胞模型(常温缺氧12 h，复氧4 h)发现，HSYA可显著降低乳酸脱氢酶、胱天蛋白酶(caspase)-3的水平，减轻氧化应激损伤和凋亡。进一步用PI3K抑制剂(LY294002)或己糖激酶Ⅱ抑制剂(3-BrPA)预处理，HSYA的保护作用明显减弱。说明HSYA可通过激活PI3K/Akt/己糖激酶Ⅱ通路，恢复线粒体能量代谢，减少活性氧生成，从而抑制慢性缺氧导致的细胞凋亡。

1.2抑制Janus激酶(Janus kinase,JAK)2/信号转导及转录活化因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)1信号通路 JAK/STAT信号通路是众多细胞因子信号转导的共同途径，广泛参与细胞增殖、分化、侵袭、代谢、凋亡及炎症等过程。JAK/STAT通路的激活可促进各种疾病的发生、发展。Zhou等[7]通过结扎雄性SD大鼠左冠状动脉前降支30 min后再灌注2 h建立在体缺血再灌注模型，结扎前30 min腹腔内注射5 mg/kg HSYA，结果显示，大鼠出现的心肌损伤较轻，JAK2和STAT1活性降低，抗氧化能力增强，凋亡减少；同时，他们应用H9C2心肌细胞体外制备缺氧-复氧模型，给予HSYA后观察心肌损伤、氧化应激、线粒体膜蛋白等情况，结果显示JAK2/STAT1通路的失活增强了HSYA对缺氧-复氧诱导的心肌细胞损伤的保护作用。说明HSYA治疗对减少缺血再灌注诱导的心肌损伤有效，这可能在很大程度上抑制JAK2/STAT1通路。

1.3减轻钙超载 钙超载既是IRI的原因，又是缺血再灌注的结果：①胞质内Ca2+聚积(钙超载)使肌质网及线粒体摄取钙的同时消耗大量ATP，线粒体内的Ca2+可形成磷酸钙沉淀，干扰线粒体氧化磷酸化，最终导致细胞能量供应不足。②聚积的Ca2+可激活磷脂酶类，促进细胞膜磷脂成分降解，破坏细胞膜结构。受损的细胞膜又增加了对Ca2+的通透性，进一步促进钙超载。此外，细胞内Ca2+还可激活钙依赖性蛋白水解酶，进而产生过多的自由基，损害组织细胞。③细胞内Ca2+水平升高可激活ATP酶水解高能磷酸盐，进而释放出大量H+，加重酸中毒。此外，钙超载还可引起再灌注后Na+/Ca2+交换异常，导致心律失常、肌纤维过度收缩，进而引起心肌纤维断裂。王丽娜等[23]通过结扎雄性SD大鼠左冠状动脉前降支30 min，缺血再灌注24 h建立缺血再灌注模型，再灌注前5 min经鼠尾静脉注射10 mg/kg HSYA，结果发现：静脉注射HSYA可明显降低缺血再灌注大鼠Ca2+升高的幅度，且可明显增加肌质网钙泵肌质网钙ATP酶的含量，该酶可调控细胞器钙库对Ca2+的重新摄入。提示HSYA可减轻缺血再灌注损伤后心肌细胞中出现的钙超载，并明显提高钙库对Ca2+的摄入，其作用是通过肌质网钙ATP酶调控的。

1.4减轻炎症反应 缺血再灌注时，细胞黏附分子、趋化因子与细胞因子生成增多，导致炎症反应过度激活，引起微血管损伤及细胞损伤。刘永刚等[24]通过结扎大鼠冠状动脉左前降支40 min后再灌注160 min，建立心肌IRI模型，于结扎左冠状动脉10 min后经股静脉给予HSYA，测定心肌梗死面积、心肌酶学、心肌组织中炎症细胞因子[白细胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α等]的水平以及髓过氧化物酶活性。结果显示，HSYA可减少心肌缺血再灌注后大鼠心肌标志酶乳酸脱氢酶、肌酸激酶同工酶、血清肌钙蛋白的漏出，并通过减轻心肌炎症反应保护心肌细胞。张园和张妍[25]通过结扎大鼠冠状动脉左前降支30 min，再灌注120 min，建立心肌IRI模型。其中HSYA组于造模前14 d分别给予10、20 mg/kg的HSYA，灌胃给药。比较两组大鼠肿瘤坏死因子-α、IL-6、C反应蛋白等炎症指标和心肌组织学指标发现，与模型组相比，HSYA组炎症和心肌损伤明显减轻。提示HSYA保护心肌IRI的机制可能与调控炎症因子，减轻炎症反应有关。

1.5激活AMP活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信号通路 AMPK是调控能量稳态的重要激酶，也称“细胞能量调节器”，主要用于协调代谢，维持能量的供求平衡。AMPK具有调控蛋白质代谢(如通过调节哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路抑制蛋白质合成)、脂质代谢(如促使乙酰辅酶A羧化酶和3-羟基-3-甲戊二酸单酰辅酶A还原酶磷酸化，从而抑制肝脂肪酸和胆固醇合成)、糖类代谢(如通过葡萄糖转运体向胞膜转位以增加机体对葡萄糖的摄取，或抑制果糖1，6-二磷酸酶抑制糖异生，最终降低血糖)、诱导细胞凋亡(如通过促进氧化应激诱导凋亡)、调节自噬和线粒体稳态(如通过磷酸化unc-51样激酶促进线粒体自噬[26]；同时通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α转录调控新的线粒体产生，实现线粒体的净化作用)及抗炎、抗衰老等作用[27-28]。Ye等[13,29]通过结扎成年雄性SD大鼠前降支30 min再灌注24 h建立IRI模型，分别于结扎左冠状动脉前降支前30 min或再灌注后30 min经鼠尾静脉注入HSYA，结果发现HSYA可通过激活AMPK信号通路，抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路，增加细胞自噬，抑制炎症介质上调，最终减少心肌细胞凋亡，缓解心肌缺血再灌注损伤。

1.6诱导药理性预适应 药理性预适应是指预先给予某种损伤性刺激后，机体组织器官对这些有害刺激产生的耐受性或适应性。而缺血预适应则是指短期缺血应激使机体对随后长时间的缺血再灌注损伤产生明显保护作用的一种适应性机制。目前缺血性预适应已经扩展到药理性预适应，即应用药物替代缺血以诱导预适应样保护作用。张建军等[30]使用成年Wistar大鼠建立缺血预适应模型(缺血5 min、再灌注5 min，循环3次)及缺血再灌注模型(结扎左冠状动脉30 min造成缺血，再灌注120 min)，缺血再灌注模型中，缺血前15 min及再灌注后15 min分别经鼠尾静脉注射HSYA。通过检测心肌梗死面积、血浆降钙素基因相关肽、6-酮基-前列腺素F1a等指标，观察缺血预适应和HSYA对心肌IRI的影响。结果显示，HSYA对心肌IRI的影响与心肌缺血预适应相似[30]。线粒体分子Cx43是一种缝隙连接蛋白，研究发现增加Cx43的表达可增强缺血性预适应的心肌保护作用[31]。孙玉芹[32]研究发现，给予HSYA治疗后心肌细胞线粒体Cx43的表达升高，具有抗IRI的作用，其作用与缺血性预适应相似。以上研究提示，HSYA对心肌IRI的保护作用可能部分与诱导缺血性预适应有关。

2 HSYA对脑IRI的保护机制

2.1抑制炎症介质释放，降低自由基反应 氧自由基的生成是导致IRI的重要机制。氧自由基可诱导炎症因子产生，加重再灌注损伤。清除超氧阴离子或抑制氧自由基的生成可有效减轻IRI。HSYA通过抑制IL-6、IL-1b、肿瘤坏死因子等炎症介质释放，减轻一氧化氮合酶、髓过氧化物酶等自由基反应引发的继发性脑损伤，发挥保护作用[9]。Sun等[33]认为，HSYA的保护作用至少部分来自局部缺血再灌注后炎症反应的抑制。

2.2激活PI3K/Akt信号通路 PI3K/Akt是细胞内重要的抗凋亡信号通路。Akt是PI3K信号通路中重要的下游靶点，参与细胞生长、代谢及抗凋亡等多种生物学过程。IRI时抑制了PI3K/Akt信号通路，但激活了下游的糖原合成酶激酶-3β，而糖原合成酶激酶-3β可激活caspases家族和Bcl-2家族中相关凋亡因子，进而促进细胞凋亡[34-35]。谭燕萍等[36]采用线栓法复制成年SD大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，造模成功后经鼠尾静脉注入HSYA 5 mg/kg，结果发现HSYA具有神经保护作用，这可能与血小板衍生生长因子介导的PI3K/Akt通路的激活有关。Chen等[37]通过堵塞大脑中动脉建立Wistar大鼠缺血再灌注模型，堵塞后15 min经鼠尾静脉注入HSYA，结果发现HSYA防止脑IRI部分是通过激活PI3K/Akt信号通路，减少再灌注损伤导致的细胞死亡发挥作用。

2.3关键枢纽蛋白 HSYA通过影响部分关键枢纽蛋白的表达而起到减轻IRI的作用。戚智锋等[38]用线栓法制备大脑中动脉缺血1.5 h再灌注72 h模型，其中实验组于缺血30 min、再灌注时、再灌注24 h、再灌注48 h 4个时间点经鼠尾静脉分别注射2 mg/kg的HSYA，对照组给予同剂量生理盐水。结果显示实验组通过降低半影区基质金属蛋白酶9蛋白的表达，提高claudin-5蛋白的表达水平，减轻半影区血脑脊液屏障损伤。Xu等[39]采用无标记定量蛋白组学分析方法研究调节蛋白对大鼠脑IRI的影响，结果发现HSYA对抗脑IRI的关键枢纽蛋白是Eftud2、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白、Rab11、Ppp2r5e。

2.4抗氧化作用 IRI情况下，化学性质活泼的自由基产生过多，在体内可破坏蛋白质和核酸的结构与功能、引起脂质过氧化，造成机体损伤。Sun等[40]将SD大鼠大脑中动脉堵塞60 min，再灌注24 h建立脑IRI模型，给予不同剂量的HSYA后发现，12/15-脂氧合酶的表达和活性降低，免疫球蛋白G漏出和脑组织水的含量减少，提示HSYA减弱了脑蛋白的氧化和硝基化修饰，并呈剂量依赖效应，提高了血脑屏障的渗透性，减少了脑水肿发生。Wei等[41]将成年雄性Wistar大鼠大脑中动脉堵塞2 h，再灌注24 h建立脑IRI模型，给予不同剂量的HSYA后观察丙二醛、超氧化物歧化酶、总抗氧化能力等的情况发现，HSYA可通过抗氧化作用对抗脑IRI引起的神经元损坏。

2.5抑制线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的开放 mPTP在IRI时的细胞存活和死亡中扮演重要角色。在不同刺激因素诱导的凋亡中，mPTP被打开，线粒体跨膜电位下降，细胞色素C、Ca2+及某些胱天蛋白酶原释放至胞质中，最终导致细胞凋亡[42]。Ramagiri和Taliyan[43]发现，HSYA治疗可明显改善IRI大脑的脑神经损伤严重程度、旋转实验、Y迷宫等的评分，降低肿瘤坏死因子-α水平和脑梗死率，但在治疗前20 min用mPTP开放剂羧基苍术苷处理后，HSYA的保护作用减弱，提示HSYA的保护作用可能是通过抑制mPTP开放实现。Huang等[44]的研究探讨了HSYA影响缺血再灌注时脑微血管内皮细胞线粒体的机制，用U0126抑制胞外信号调节激酶，用CypD(Cyclophilin D)干扰小RNA转染，以反向验证HSYA的保护作用是否通过调节促分裂原活化的蛋白激酶/胞外信号调节激酶/CypD通路发挥作用。结果显示，HSYA预处理显著提高了微血管内皮细胞的活力，减少了缺氧缺糖复氧后活性氧的产生、mPTP的开放和细胞色素C的易位。提示HSYA对缺血再灌注的保护作用可能是通过抑制促分裂原活化的蛋白激酶/胞外信号调节激酶/CypD通路mPTP的开放，减少线粒体细胞色素C的输出实现。

2.6抑制Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)4通路介导的信号反应 TLR是机体重要的免疫系统识别受体，参与调控与维持免疫反应的平衡。适度活化的TLR可刺激免疫应答、清除病原体保护机体，但如持续活化，则会损伤机体[45]。TLR4通路与感染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病等的发生密切相关。Lv等[46]制备大脑中动脉缺血再灌注小鼠模型后，用HSYA处理发现TLR4的表达下降，凋亡神经元数量明显减少，脑梗死和炎性神经元损伤得到显著缓解，提示HSYA可能是通过抑制TLR4通路介导的信号反应发挥神经营养和抗炎功能。

2.7其他机制 盛雨辰等[47]的研究提示，HSYA对脑IRI的保护作用可能与抑制诱导型一氧化氮合酶过表达有关。Chen等[11]研究发现，在小鼠大脑的IRI中苯丙氨酸显著增加，而HSYA可抑制IRI后苯丙氨酸的合成，增强线粒体功能，起到神经保护作用。Yu等[48]发现，HSYA具有保护脑IRI认知功能和突触可塑性的作用，认为HSYA可能是脑缺血损伤后认知功能恢复的良好选择。Xu等[39]的研究提示，缺氧诱导因子1信号通路是HSYA抗脑IRI的关键通路。

3 HSYA对其他器官IRI的保护机制

3.1HSYA对肾IRI的保护机制 核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)是TLR4信号通路中的关键转录因子，活化的NF-κB可引起促炎性细胞因子释放。Bai等[49]通过切除SD大鼠右肾，建立左肾IRI模型，以评价HSYA通过TLR4/NF-κB通路对缺血再灌注诱导的急性肾损伤在体内外的保护作用。结果显示：在体内，HSYA治疗可明显降低血清肌酐和血尿素氮的水平，减少肾细胞凋亡，减轻肾组织形态学变化，减少IL-1β、肿瘤坏死因子-α、caspase-3释放；在体外，HSYA能有效降低NF-κB/p65和炎症细胞因子(如IL-1β、肿瘤坏死因子-α和IL-6)的水平。提示HSYA对肾IRI具有保护作用，可能与阻断TLR4/NF-κB通路导致炎症反应有关[50]。用肾小管上皮细胞(HK-2细胞)制备冷缺氧-复氧模型，冷缺氧前30 min用HSYA预处理，以观察HSYA对HK-2细胞损伤是否有保护作用。结果显示，25 μmol/L HSYA预处理可有效提高细胞存活率，其保护机制可能与调节细胞自噬和线粒体功能以及直接抗氧化有关[50-51]。

3.2HSYA对肝IRI的保护机制 沉默信息调节因子1(silence information regulator 1，SIRT1)是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的蛋白去乙酰化酶，其性质稳定、保守。SIRT1在细胞凋亡、分化及代谢的调节中具有重要作用，但其生物学功能需要叉头框蛋白O、c-myc癌基因、NF-κB、人胰岛素样生长因子结合蛋白1、p300、p53等蛋白的参与。SIRT1可以调控叉头框蛋白O1蛋白去乙酰化，参与细胞的应激、凋亡、衰老和代谢等过程，从而减轻IRI[52]。朱仁英等[19]发现，HSYA预处理可以缓解肝脏IRI，减少中性粒细胞浸润，且肝组织中SIRT1和乙酰化叉头框蛋白O1/叉头框蛋白O1蛋白水平升高；而加入SIRT1抑制剂后，肝细胞坏死及中性粒细胞浸润均较之前增加，且SIRT1和乙酰化叉头框蛋白O1/叉头框蛋白O1蛋白水平降低，提示HSYA预处理可激活SIRT1/叉头框蛋白O1通路，通过缓解氧化应激，实现对肝IRI的保护作用。

3.3HSYA对脊髓IRI的保护机制 Shan等[53]通过闭塞主动脉建立成年新西兰公兔脊髓缺血再灌注模型，其中HSYA治疗组在缺血前30 min经左耳静脉给予10 mg/kg HSYA。术后48 h进行神经功能评估、组织病理学检查、生化分析以及细胞凋亡检测，结果显示：与缺血再灌注组相比，HSYA治疗组脊髓坏死有所减轻，神经功能有所改善，氧化应激得到缓解，提示HSYA可能通过减轻氧化应激和减少神经元凋亡保护脊髓免受IRI。

4 小 结

目前关于HSYA在心肌、脑、肝脏、脊髓等IRI中作用的研究，针对的是正常体温下热IRI的保护作用及相关机制，对HSYA在器官移植的冷IRI中的保护作用研究较少。器官移植时离体器官需低温保存以提高离体器官对IRI的耐受能力[54]。如HSYA在器官移植的冷IRI中有保护作用，将大大增加器官移植的成功率。目前，冷热IRI中的给药剂量、给药方式及给药时间各有不同，需进一步研究。HSYA对IRI的保护作用与多种机制有关，如激活PI3K/Akt信号通路、抑制JAK2/STAT1信号通路、激活SIRT1/叉头框蛋白O1通路、抑制炎症介质释放，降低自由基反应、抗氧化、减轻钙超载、抑制mPTP的开放等，各机制之间是否存在关联尚不十分清楚，且大多机制探讨还处于推测阶段，需进一步验证。HSYA在体内的代谢过程直接影响其药效发挥，机体的健康状态也影响药物的代谢。深入研究HSYA对IRI的作用机制，可为临床安全、合理使用药物预防提供理论基础。