铁死亡在致盲性眼病中的相关研究进展

樊倩，张伟，李严为，欧阳东，王虹霞

(1.天津市眼科医院 天津市眼科学与视觉科学重点实验室 天津市眼科研究所 南开大学附属眼科医院眼科，天津 300020；2.上海市中医药大学附属光华医院 上海市光华中西医结合医院眼科，上海 200052)

细胞死亡是维持细胞周期及机体稳态的重要机制，主要分为程序性细胞死亡与调节性细胞坏死两种类型。依据细胞坏死发生过程中的形态学变化及具体分子机制，可以将调节性细胞坏死分为坏死性凋亡、焦亡、铁死亡、自噬性死亡、多腺苷二磷酸核糖聚合酶1依赖性细胞死亡等[1-2]。不同调节性细胞坏死激活的下游分子途径有所不同。铁死亡作为调节性细胞坏死的一种重要类型，主要通过长链脂酰辅酶A合成酶4(long-chain acyl-CoA synthetase 4，ACSL4)/溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3/花生四烯酸酯15-脂氧合酶通路实现细胞死亡。目前认为在诸多调节性细胞坏死的机制中，铁死亡与心肌梗死、脑缺血再灌注损伤、实体器官移植等病理生理过程有关[3]。此外，铁死亡还参与致盲性眼科疾病，如青光眼、老年性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)和视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)的发生发展。Sun等[4]通过体外培养的AMD标准模型证实，铁死亡和自噬是谷胱甘肽减少诱发视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)死亡的两种方式，铁死亡抑制剂在抑制原代RPE细胞死亡方面优于细胞凋亡或坏死性抑制剂。现就铁死亡在致盲性眼病中的相关研究进展予以综述。

1 坏死性凋亡的作用机制

坏死性凋亡是由受体相互作用蛋白激酶1和受体相互作用蛋白激酶3调节的一种胱天蛋白酶(caspase)非依赖性细胞死亡途径。坏死性凋亡途径通过多种先天免疫信号转导，包括死亡受体、干扰素、Toll样受体或细胞内RNA以及伴随着受体相互作用蛋白激酶1/3和假激酶混合谱系激酶类结构域样蛋白[5]。在细胞凋亡中，caspase家族的部分蛋白被炎症小体激活，并被切割为成孔蛋白Gasdermin E，成孔蛋白激活后转位到细胞膜上，形成孔洞，细胞肿胀，胞质溢出，细胞膜最终破裂崩解，其具体机制是通过炎症小体感知刺激因素，进而活化caspase-1，活化的caspase-1切割并激活白细胞介素-18、白细胞介素-1β等炎症细胞因子，进一步切割Gasdermin D的N端序列，使其与膜结合并产生膜孔，导致细胞焦亡[6]。敲除Gasdermin E后，caspase-3的激活程度显著降低，表明Gasdermin E可作为细胞凋亡执行蛋白caspase-3的另一个“开启”开关。而铁死亡作为调节性细胞坏死的一种重要类型，主要通过ACSL4/溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3/花生四烯酸酯15-脂氧合酶通路实现细胞死亡[3]。而多腺苷二磷酸核糖聚合酶1依赖性细胞死亡是一种与细胞凋亡或坏死性凋亡不同的程序性细胞死亡，该过程不需要caspase的参与，但是依赖于多聚二磷酸腺苷核糖信号和核凋亡诱导因子移位[7]。

2 铁死亡的作用机制

2.1铁死亡的特点 铁死亡是较特殊的细胞死亡形式，2012年由Dixon等[8]首次报道，随后引起广大研究人员的重视。细胞死亡命名委员会更倾向于以细胞死亡的分子学进行分类，“铁死亡”的名字由此而来。铁死亡是一种细胞死亡过程，由铁离子依赖的脂质过氧化作用驱动，以细胞膜完整性丧失和细胞质内容物释放为特征。铁死亡具有以下特点：细胞死亡过程中伴随着大量铁离子的累积，同时出现脂质过氧化；在细胞的亚结构中，线粒体变小、膜皱缩，同时线粒体嵴减少、消失，外膜破碎。这种死亡形式与铁离子介导细胞的氧化还原失平衡相关，主要启动因素是细胞膜磷脂的过氧化，而铁死亡中过氧化底物是多聚多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PL-PUFA)。细胞中影响PL-PUFA代谢的主要通路有铁离子代谢通路、谷胱甘肽通路和泛醇/泛醌通路，其均可参与铁死亡过程。亚铁离子(Fe2+)是参与铁死亡不可或缺的因素，在氧化应激条件下，超氧化物可诱导细胞释放Fe2+、血红素、铁硫簇和铁蛋白。铁蛋白的特异性自噬(又称铁蛋白吞噬)降解由核受体辅活化子4介导[9]，而核受体辅活化子4作为一种铁蛋白受体，可识别和表达铁蛋白，并将铁蛋白招募至自噬体进行溶酶体降解，继而导致游离铁离子释放。敲减或过表达核受体辅活化子4基因可分别抑制或诱导铁蛋白吞噬和铁死亡。Olamine通过铁离子螯合剂(去铁胺或环磷酰胺)减少铁离子过负荷，可阻断erastin诱导的铁死亡，而提供外源性药物铁的来源(六水氯化铁、柠檬酸铁或柠檬酸铁铵等)可促进erastin诱导的铁死亡。

2.2铁死亡的旁路调节 除铁离子外，氨基酸代谢通路也参与铁死亡的调节过程。谷氨酸和谷氨酰胺是铁死亡的关键调节因子[10]。谷氨酸通过反转运蛋白胱氨酸，以1∶1的比例交换为胱氨酸。细胞外高浓度的谷氨酸通过阻断半胱氨酸转运导致铁死亡。当谷氨酰胺缺乏或分解被抑制时，阻止胱氨酸输入和胱氨酸缺乏不能引起脂质过氧化、活性氧积累，最终导致铁死亡。在谷氨酰胺分解过程中，谷氨酰胺酶2催化谷氨酰胺转化为谷氨酸，是铁死亡的必经过程[11]，上调谷氨酰胺酶2可导致p53依赖性铁死亡，p53在直接转录水平抑制溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11，SLC7A11)的表达，亦可通过转录上调下游的精脒/精胺N1-乙酰基转移酶1通路，进而参与铁死亡过程。另外，p53可通过抑制二肽基肽酶-4的活性抑制铁死亡[12]。

磷脂过氧化物酶——谷胱甘肽过氧化物酶(phospholipid peroxidase glutathione peroxidase，GPX)4和ACSL4与脂质过氧化密切相关，常作为铁死亡过程的生物标志物[13-14]。GPX4是一种抗氧化酶，可将潜在的毒性脂质过氧化物还原为无毒的脂质醇，这是预防铁死亡的重要过程，在此过程中，GPX4利用谷胱甘肽作为辅助因子，将还原型谷胱甘肽转化为氧化型谷胱甘肽，随后氧化型谷胱甘肽被谷胱甘肽还原酶和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸/H+还原，使还原型谷胱甘肽再循环[14]。敲除GPX4可触发依赖铁离子和活性氧的铁死亡，而GPX4过表达可抑制铁死亡。小分子(如erastin)耗竭或GPX4抑制剂(1S，3R)-RSL3直接抑制GPX4的活性可导致GPX4失活，进而导致PL-PUFA过氧化和脂肪酸自由基产生，最终导致细胞死亡[15]，PL-PUFA过氧化是铁死亡致细胞凋亡的主要环节。除直接抑制GPX4外，ACSL4还参与铁死亡过程中氧化磷脂酰乙醇胺的产生，如花生四烯醇磷脂酰乙醇胺和肾上腺酰磷脂酰乙醇胺，它们是致死性脂质种类和铁死亡的诱导剂。在敲除ACSL4基因时，细胞内的脂质过氧化和铁死亡过程被阻断[16]。

综上所述，铁死亡可能由铁离子、谷氨酸及PL-PUFA的代谢累积或通过耗竭内源性铁死亡抑制剂GPX4与谷胱甘肽引起，并通过此通路参与视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell，RGC)、RPE和视锥细胞的凋亡过程。既往研究显示，激活N-甲基-D-天冬氨酸(N-mehyl-D-aspartate，NMDA)/二价金属离子转运体1通路可引起细胞内Fe2+含量增加，从而导致青光眼患者的RGC死亡，而铁离子的积累或GPX4/谷胱甘肽水平的降低抑制了胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白活性，可分别导致AMD、RP的RPE和视锥/视杆细胞凋亡。铁离子螯合剂(去铁胺)和铁死亡抑制剂(铁抑素-1)可阻断RGC、RPE或视锥细胞的铁死亡过程[17]。因此，铁死亡机制在多种致盲性眼病的发生发展中发挥重要作用。

3 铁死亡与致盲性眼病

目前，铁死亡的研究热点和临床应用多集中于神经系统疾病、缺血再灌注损伤、肿瘤等，此外，眼科相关疾病(青光眼、AMD、RP、视网膜母细胞瘤)也涉及铁死亡。

3.1铁死亡与青光眼 RGC的退行性改变是青光眼的主要病理特征。由于铁离子和谷氨酸的运输和代谢失调，多种通路通过激活铁死亡参与RGC凋亡过程。现已证实，NMDA受体通过激活鸟苷三磷酸结合蛋白Dexras1，进而激活铁转运体(即二价金属离子转运体1)，最终诱导铁离子内流。选择性铁离子螯合剂可显著降低小鼠体内NMDA的兴奋性毒性，Dexras1的耗竭能够减轻NMDA诱导的RGC死亡，提示Dexras1在介导铁离子内流和铁死亡中起关键作用[18]。Sakamoto等[19]研究发现，玻璃体腔注射NMDA第7天，视网膜RGC内Fe2+积聚、细胞丢失，而铁螯合剂治疗可防止NMDA诱导的视网膜损伤，同时减少Fe2+积聚和脂质过氧化。NMDA受体在青光眼相关铁离子转运中起重要作用，阻断NMDA受体可能有预防铁死亡的作用。此外，氧化应激通路是导致青光眼RGC凋亡的另一个重要机制。一项临床研究表明，原发性开角型青光眼患者血浆维生素E和维生素C水平显著低于健康人群，推测维生素E(SEC14L2)和维生素C(SLC23A2)相关基因的多态性分别与原发性开角型青光眼的高风险相关[20]。然而，低水平血浆抗氧化剂以及原发性开角型青光眼视网膜氧化损伤修复与铁死亡的关系仍有待进一步研究。

3.2铁死亡与AMD 大量进行性RPE凋亡是绝大多数AMD患者出现非新生血管性AMD的主要病变特征。目前认为，铁死亡参与调控AMD病程中的RPE凋亡。Hahn等[21]研究发现，AMD患者视网膜中总铁含量高于同龄健康人，铁诱导生成的氧自由基参与AMD中RPE细胞的损伤过程。在采用叔丁基过氧化物处理的AMD体外细胞模型的RPE细胞中，铁死亡抑制剂(铁抑素-1)和铁离子螯合剂(去铁胺)可显著逆转Fe2+的累积、脂质过氧化和谷胱甘肽耗竭等。外源性铁的增加可促进叔丁基过氧化物诱导的RPE细胞死亡，该过程可被铁抑素-1与去铁胺抑制，表明部分叔丁基过氧化物诱导的RPE细胞死亡由铁死亡所致[22]。

目前AMD发生铁死亡的直接证据尚未明确，但在AMD患者中可观察到铁离子运输和代谢失调的发生。干性AMD患者RPE中存在年龄依赖性的铁含量增加[22-23]；AMD患者黄斑RPE和Bruch膜的总铁水平高于同龄人群正常黄斑[24]；干性AMD患者房水铁含量是正常人群的2倍以上[25]。由此可见，铁代谢参与了AMD中RPE细胞的凋亡过程。

氧化应激亦是导致RPE凋亡的重要机制之一，一些抗氧化酶功能失调被认为是参与AMD中RPE细胞铁死亡的原因。谷胱甘肽是一种重要的抗氧化剂，而GPX是谷胱甘肽生物合成至关重要的谷胱甘肽依赖酶。谷胱甘肽缺失导致GPX4失活，加速细胞内脂质过氧化进程，继而引发铁死亡[11]。谷胱甘肽对保护RPE免受活性氧损伤至关重要，谷胱甘肽的缺失可导致体外培养的ARPE-19细胞发生早衰，细胞活力降低，活性氧生成增加，GPX4表达降低，最终导致RPE凋亡[4]。谷胱甘肽缺乏引起的铁死亡与ARPE-19细胞凋亡有关，铁离子螯合剂(去铁胺)和选择性铁死亡抑制剂(铁抑素-1)可减轻细胞凋亡。由于ARPE-19细胞早衰可能与AMD的特征有关，谷胱甘肽功能异常引起的铁死亡可能参与AMD的发病。

3.3铁死亡与RP 目前人类已知的感光细胞有视杆细胞、视锥细胞和RGC 3种。RP中视杆细胞和视锥细胞呈现累积性的退行性凋亡，铁死亡可能参与光感受器细胞的死亡。在rd10小鼠RP模型中，铁螯合剂(去铁胺)可减弱铁离子相关氧化应激，光感受器退行性变与视网膜铁蛋白减少以及脂质过氧化水平的降低有关[26]。去铁胺可减少暴露于强荧光灯下小鼠视网膜的光损伤，与未给予去铁胺组小鼠相比，给予去铁胺小鼠光感受器细胞的细胞核保存较好，存活的光感受器较多[27]。另有研究证实，VK28和VAR10303(铁螯合药物)可部分挽救rd10小鼠RP模型视锥细胞，显著改善其视功能[28]。

多数对铁死亡参与RP发病的研究显示，上调某些抗氧化酶的活性可使光感受器免受氧化损伤。GPX4和超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)是视网膜中重要的抗氧化酶。研究显示，光感受器细胞中诱导过GPX4的转基因小鼠的视网膜结构与功能更佳，而与SOD1水平正常转基因小鼠相比，SOD1缺乏RP小鼠视网膜的损伤氧化应激反应更轻[29]。SOD1缺乏rd10小鼠RP模型的视网膜氧化损伤加重，视锥细胞丢失加快，而SOD1和GPX4的共同表达可降低视网膜氧化损伤[29]。SOD1缺乏以及SOD1过度表达、GPX4表达水平降低的RP小鼠模型的视网膜氧化损伤增加，视锥细胞生理功能丧失加快[29]。以上研究提示，GPX4对保护光感受器免受氧化损伤至关重要，上调GPX4活性可能是治疗RP的一种潜在途径。

3.4铁死亡与视网膜母细胞瘤 视网膜母细胞瘤是一种婴幼儿多发的眼部恶性肿瘤，6%为常染色体显性遗传，94%为散发病例，其中25%为基因突变，余为体细胞突变。视网膜母细胞瘤的发病机制复杂，可致盲甚至致死，确切病因目前尚未明确，且尚无有效的治疗手段。目前认为，p53基因突变、视网膜母细胞瘤1基因缺失是视网膜母细胞瘤发病的重要原因，而p53基因、视网膜母细胞瘤1基因均参与了铁死亡。p53基因在细胞周期内扮演重要角色，具有抑细胞凋亡、促细胞增生的作用，许多肿瘤中均有p53的表达，且通过普通化学性手段无法将p53检出。p53的表达水平与肿瘤的发生密切相关，视网膜母细胞瘤中其表达水平明显高于正常视网膜组织[30]。

4 小 结

近年来，铁死亡相关的研究均取得了较大进展，现已明确铁死亡参与多种致盲性眼病的发生和进展过程，包括青光眼、AMD和RP等。铁死亡通路为退行性改变导致的致盲性眼病的研究提供了新的方向，针对致盲性眼病信号通路的研究可能有助于寻找新的治疗方法，如明确特异性基因治疗作用靶点、开发有效的抑制性药物，进而干预或延缓疾病进展。干预铁死亡通路可能是一种潜在的眼病治疗新策略，深入研究铁死亡在眼科疾病中的作用及机制将为未来多种致盲性眼病的临床治疗带来新的希望。