光遗传学技术在尿控领域应用的研究进展

2022-12-06薛原，陈忠

现代泌尿外科杂志 2022年9期

薛原，陈忠

(上海交通大学附属上海市第六人民医院泌尿外科，上海 200233)

光遗传学(optogenetics)是一种将光控与遗传学相结合的新技术。其基本原理为通过基因工程手段，将光敏蛋白导入特定神经或肌肉细胞，使其在特定波长的光刺激下产生兴奋或抑制。这一技术最早被应用于神经网络功能的研究，而后逐步发展至视网膜病变、心脏起搏、疼痛治疗等领域[1-3]。

近年来，光遗传学在尿控领域的应用逐渐增多，并初步展现出其用于探究排尿高级中枢功能及调控下尿路活动的优势。本文旨在回顾总结光遗传学的机制及其在尿控领域应用的实验进展，为后续研究提供思路。

1 光遗传学的机制与发展历程

“光遗传学”一词原指“通过基因靶向技术使特定神经元或蛋白与光学技术相结合，从而用于成像或调控目标活动的过程[4]”。其核心为将光信号转化为电信号从而调控细胞活动的激动蛋白和将电信号转化为光信号从而成像的指示蛋白[5-9]。随着前者应用于调节细胞或者组织活动所取得的巨大成功，现在狭义的光遗传学仅包含前者，即“通过基因与光学技术相结合从而实现特定细胞或活组织获得或失去功能的过程[5]”。在本文中，我们仅对狭义的光遗传进行讨论。

1.1 视蛋白的发现与应用视蛋白(opsin)是一类在动物视觉系统及部分微生物体内中广泛存在的光敏蛋白。在视蛋白家族中，微生物视蛋白由于同时具有光敏和效应器结构域，因此能够使非光敏细胞获得对特定波长和强度的光的敏感性。文献报道2005年KARL的团队证实光敏通道蛋白2(channelrhodopsin-2,ChR2)能够产生足以激活哺乳动物神经元的动作电位[10]。这是一种能够被470 nm蓝光激活的非特异性阳离子通道蛋白，当其被激活时，Na+、Ca2+等进入细胞，引起细胞去极化产生动作电位。同时，ChR2的反应速度极快，可以在被光照激活50 μs内产生电流。这一发现具有里程碑式的意义，开启了光遗传学的新时代，使人们可以在毫秒级的时间精度上调节神经活动。此后，更多ChR2家族的亚型被构建以实现更快的神经动作。

光遗传学不仅可以用于激发神经元动作电位，也可以靶向抑制神经元。嗜盐菌视紫红质(natronomonas pharaonis halorhodopsin，NpHR)是一类来自古细菌的氯离子泵，当其表达于特定细胞后可以在580 nm黄光照射下将氯离子转运进入细胞，使细胞超极化并沉默[9]。由于激活波长不同，ChR2与NpHR可以在同一细胞内共同表达，从而独立诱导细胞的激活或沉默。这使得人们能够更加灵活地调控细胞活动。

ChR2和NpHR是最早、最经典的光遗传学组件，目前仍被广泛应用。在不久的将来，一些新出现的光敏蛋白可能会取代他们，如C1V1(Chlamydomonas and Volvox ChR1)、Chronos、Jaws、Arch、BLINK1(blue-light-induced K+channel 1)、ACR(anion-selective channelrhodopsin)[11-13]等。这些光敏蛋白在激活波长、反应速度等方面各有不同，为光遗传学的应用提供了更加丰富的选择。

1.2 光遗传学组件的构建和导入由于神经细胞的高度多样性和复杂性，标记目标细胞并使视蛋白特异性表达对实现光遗传学的空间特异性十分重要。目前最为常用且简便的方法是将编码细胞特异性启动子、光敏蛋白的基因片段包装在病毒载体中并注射到靶细胞区域，通过病毒转染实现视蛋白的表达[14]。常用的工具病毒包括慢病毒(lentivirus)、腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)[15-16]等。但病毒载量有限，对启动子的编码长度有一定限制。而构建转基因动物系，并通过Cre/loxp等重组酶系统实现视蛋白的特异性表达的方法则无此限制，较病毒转染更加高效稳定，但其成本较高、培育周期长。此外，也可将病毒与重组酶系统相结合，如将编码Cre重组酶的病毒局部注射到loxp转基因动物的靶细胞区域，既解决了对编码长度的限制，也能够一定程度降低成本，因此也得到了广泛使用。

1.3 光照系统当光敏蛋白被整合进目标细胞后，就可以通过光照刺激其产生激活或抑制作用。常用的光源包括发光二极管(light-emitting diode，LED)、激光等，其中LED成本低廉、结构简单，可以进行无线刺激，可以完全植入体内，更加符合生理条件，但光照波谱不够集中；激光的波谱范围窄，波束集中，能够更加准确的激活特定光敏蛋白，但需要光纤连接，侵袭性相对较大，且价格相对高昂[17-18]。近年来，可被近红外光(near-infrared-light，NIR)激活的纳米材料开始应用于光遗传学领域[19]。近红外光与光遗传学所需的黄光、蓝光等可见光相比具有更强的穿透性，可以直接通过体外光源照射目标区域。而这些纳米材料则可以在动物体内将接收到的近红外光转化为可见光，从而在局部激活光敏蛋白，实现光遗传学调控。

1.4 光遗传学技术的优势光敏蛋白在特定类型细胞的表达、限定的光照位置及光照波长保证了光遗传学的空间特异性，而光敏蛋白的快速反应性则保证了光遗传学的时间特异性。相较于传统的电刺激与神经药理学方法，光遗传学技术弥补了前者易损伤细胞、刺激范围不精确，后者起效慢、特异性不高的缺点，能够以毫秒级速度精确地兴奋或抑制特定类型细胞，为深入研究各神经环路及其作用、机制等研究提供了新思路、新方法，因此被广泛认可并寄予厚望。

2 光遗传学在尿控领域的应用

鉴于光遗传学在神经科学领域所取得的成功，近年来越来越多的研究者选择将光遗传学技术应用于尿控领域。光遗传学技术一方面可以作为一种治疗手段，通过调节功能明确的神经或肌肉活动，从而控制储尿及排尿，另一方面也可作为一种探究手段，用于验证特定类型神经元在排尿过程中发挥的作用。

2.1 光遗传学用于治疗下尿路功能障碍在适当的环境下进行储尿或排尿是下尿路(lower urinary tract, LUT)的主要功能。这一过程有赖于膀胱与括约肌的协调活动，由一套复杂的神经网络支配完成，包括脑、脊髓及外周神经元[20]。由于其结构的复杂性，脊髓损伤[21]、糖尿病[22]等多种疾病均可导致下尿路功能异常，形成下尿路功能障碍(lower urinary tract dysfunction, LUTD)，产生尿潴留、尿失禁、膀胱过度活动(overactive bladder, OAB)等症状，影响患者的生活质量。然而，传统的药物治疗(如抗胆碱能药物、β3受体激动剂、肉毒素A)和神经调节术由于缺乏靶向特异性，往往疗效有限或产生难以规避的副作用[23-24]。因此，如何实现高效可控的储尿与排尿调节一直是人们关注的重点。而光遗传学技术的出现为此创造了希望。通过局部调节支配膀胱、逼尿肌的脊髓或外周神经活动，光遗传学在动物模型中实现了对下尿路功能的调控，有望在未来替代骶神经调节术等传统的电刺激神经调节术。

AWAD等[25]将光遗传学应用于脊髓损伤后神经源性膀胱的治疗。通过慢病毒载体将ChR2分别转染至成年大鼠脊髓L6～S2节段，并于T8节段损伤脊髓，构建了脊髓损伤大鼠模型。当光刺激脊髓神经元时，这些大鼠的排尿功能较光照前有所恢复。

PARK等[26]使用腺病毒作为转染载体，将其注射进野生型小鼠的膀胱壁，使膀胱平滑肌细胞选择性表达NpHR，并通过给予前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)成功诱导其产生了OAB症状。当蓝光照射激活NpHR时，这些OAB小鼠的膀胱内压成功下降至未经PGE2处理时的水平，表明光遗传学能够改善实验小鼠的OAB症状。由于其膀胱活动的调节是通过直接作用于平滑肌实现的，因此不会因干扰其他神经活动而产生传统药物、电刺激所产生的非自主排便、骨骼肌活动等副作用。该研究显示了光遗传学治疗LUTD的良好前景。

SAMINENI等[27]将编码抑制性光敏蛋白Arch的基因转染至间质性膀胱炎小鼠模型的膀胱疼痛感觉神经，不仅减少了膀胱疼痛，也降低了膀胱敏感性，从而减少了膀胱活动。MICKLE等[28]在此基础上设计了一套基于大鼠模型的闭环膀胱活动调节系统。这一系统包含了三部分：一个柔软可伸缩的环状压力感受器及LED光源，包裹在膀胱表面；一个植入腹部的信号基站，与压力感受器及LED光源有线连接，并可从体外无线充电；以及一个体外的信息处理器。当膀胱容量发生异常变化(如排空频率过高)时，压力感受器通过基站将信号发至体外的处理器，处理器分析信号后开启LED，从而抑制转染了Arch基因的膀胱感觉神经元，减少膀胱活动。该研究为光遗传学治疗LUTD向临床的转化创造了条件。

2.2 光遗传学用于探究排尿高级中枢功能随着fMRI等影像学手段应用于神经研究，人们对排尿高级中枢的认识越来越深入。其中，脑桥排尿中枢(pontine micturition center，PMC，亦称Barrington核，Bar)最为引人关注。多项经典研究表明，PMC作为排尿中枢在皮层上级结构网络的调控下起到了开关样的作用[20, 29-30]。然而，PMC内部细胞亚群的分类及其功能尚不明确。此外，人们对神经环路中更上级的皮质层在排尿过程中发挥的作用也知之甚少。而光遗传学技术的出现为人们深入探索排尿高级中枢的功能提供了有力武器。

HOU等[31]对PMC中表达促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing hormone，Crh)的神经元进行了研究。在转染表达ChR2后，研究者通过蓝光激活小鼠的Crh+细胞，成功检测到了较对照组频率明显升高且与光照节律吻合的的膀胱压力峰，提示Crh+细胞的激活能够诱导膀胱逼尿肌收缩。VERSTEGEN 等[32]对此进行了进一步研究。该团队首先通过逆行狂犬病毒示踪技术寻找到小鼠Bar核上游排尿相关的谷氨酸能神经元，确认其分别来自中脑导水管灰质(periaqueductal gray，PAG)和下丘脑外侧区(lateral hypothalamic area，LHA)。当二者对应区域表达囊泡型谷氨酸转运蛋白2(vesicular glutamate transporter 2，Vglut2)的谷氨酸能神经元(PAGVglut2,LHAVglut2)分别被转染ChR2并激活时，小鼠产生了节律不同的膀胱内压增高或排尿活动，提示二者在排尿调节过程中发挥了不同作用。之后，研究者为了验证这些谷氨酸能神经元是否与HOU研究中的Crh+神经元有所重合，分别使用光遗传学激活了所有谷氨酸能的Barrington核神经(BarVglut2)以及表达Crh的谷氨酸能神经元(BarCrh/Vglut2)。结果表明，相较于激活BarVglut2产生的显著排尿反应，激活BarCrh/Vglut2时仅有6%的小鼠在清醒状态下出现了排尿，且较刺激BarVglut2时反应有所延后，提示Barrington核中Crh-的谷氨酸能神经元同样在排尿的调控中发挥了重要作用。

KELLER[33]对Barrington核中特异性表达雌激素受体1(estrogen receptor 1，ESR1)的神经元进行了研究。当研究者通过AAV将ChR2特异性转染这些细胞并使其激活时，小鼠在清醒状态下立刻产生了排尿。而在麻醉状态下对这些小鼠进行尿道外括约肌肌电图检测时发现，这些小鼠在受到光照后立刻产生了外括约肌松弛。类似地，当研究者将抑制性光敏蛋白ArchT转入BarESR1后，光照立刻逆转了小鼠的外括约肌地松弛过程。这一结果提示BarESR1具有调节尿道外括约肌活动的功能。

YAO等[34]通过狂犬病毒示踪技术发现了初级运动皮层(primary motor cortex，M1)的第5层中存在部分神经元参与了排尿活动。当这些神经元被转染ChR2并激活时，研究者检测到了膀胱逼尿肌的动作电位及膀胱内压的升高。在对清醒状态小鼠进行光照时，这些小鼠产生了明显与光照节律重合的排尿。