非洲猪瘟疫苗研究进展

李运娜，王 冠，贾 皓，戴晓光，苏胜杰，王旭红

（1.内蒙古自治区动物疫病预防控制中心，内蒙古 呼和浩特 010010；2.内蒙古自治区农畜产品质量安全中心，内蒙古呼和浩特 010010）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的急性传染病。ASFV是非洲猪瘟病毒科的唯一成员，可使不同年龄的家猪和野猪感染。世界动物卫生组织将ASF规定为法定报告的疫病，该病不是人畜共患病，对公共卫生安全的影响较小，但给养猪业带来巨大的经济损失。

ASFV是一种DNA虫媒病毒，可以通过直接接触或者软蜱传播。ASFV基因组长达190 kb，病毒结构复杂，5个病毒结构层分布200多种蛋白，包括50多种结构蛋白，150多种非结构蛋白。由于其病毒结构复杂，变异度高，具有免疫逃避机制，给疫苗的研发带来一定困难［1-3］。ASFV可在猪群中快速流行和传播。此外，该病毒在环境中的稳定性较高，可存活数月甚至数年。这都给疫病的控制带来了重大的挑战。有效控制ASF疫情扩散、研制安全有效的疫苗是当前面临的最大挑战，该文对ASF疫苗的研究情况进行论述。

1 灭活疫苗

灭活疫苗是经物理或者化学方法处理，消除ASFV致病性保留其抗原性的安全疫苗。由于灭活疫苗的技术路线相对成熟，最早应用在ASF疫苗的研制上，但该疫苗并不能提供有效的保护性［4-5］。Blome等［6］将免疫佐剂PolygenTM或EmulsigenR-D（这些佐剂不仅能刺激体液免疫反应，还能刺激细胞免疫反应［7-8］）加入ASF灭活疫苗，再次评估其保护性。利用添加佐剂的ASF灭活疫苗免疫猪，6周后用同源强毒ASFV攻击免疫猪，虽然所有的免疫猪都产生了特异性抗体（可能该抗体并不具备中和活性），但均表现急性经过，疫苗并不具备保护作用。该研究表明即使加入免疫佐剂，灭活疫苗对ASFV的感染仍然无有效的保护作用。

2 减毒活疫苗

研究认为减毒活疫苗是最有希望用于预防ASF的疫苗，目前主要研究的有天然弱毒株疫苗、基因缺失弱毒株疫苗以及传代培养弱毒株疫苗。减毒活疫苗能诱导免疫动物产生细胞、体液免疫应答，对免疫动物能够提供较高水平的保护。

2.1 天然弱毒株疫苗

有研究表明，接种OURT88/3［9］、NH/P68［10］或者Lv17/WB/Rie1［11］后，免疫猪对同型强毒的攻击有较强的保护作用，其中OURT88/3致弱毒株经鼻内免疫保护率高达100%，免疫猪仅表现轻微短暂的临床症状；NH/P68致弱毒株，对于同源毒株（Lisbon60）或者异源毒株（Armenia07）的攻击，提供了100%的保护，但在免疫猪中有着明显的副作用；Lv17/WB/Rie1减毒株口服免疫野猪，对于强毒株的攻击保护率可达到92%，免疫野猪没有表现出任何临床症状。虽然该疫苗对同型强毒株有高水平的保护作用，但该疫苗生产困难，且安全性令人担忧，可产生高热、肺炎、运动障碍、母猪流产等副作用。

2.2 基因缺失弱毒株疫苗

通过基因敲除技术获得的基因缺失毒株，不但毒力减弱而且能够抵抗同源毒株的攻击［12］。目前，研究主要集中在删除免疫逃避基因或与病毒复制有关的基因。

对于ASF弱毒株，之前的研究已经表明，从不同的毒株里删除同一基因会有不同的结果，例如：从BA71病毒株中删除编码CD2v蛋白的EP402R基因，则病毒致病性减弱的同时会引起保护性反应；而从Georgia/2010株删除同一基因，病毒的毒力并未减弱［13-14］。从Georgia07株同时删除9GL和UK基因，对于同毒株的攻击提供100%的保护，而且疫苗的安全性比单独删除9GL基因更高。这可能是因为特定基因被删除后功能得到了平衡［15］，因此，在研发ASF基因缺失弱毒株疫苗时，为了减弱毒力，减少副作用，提高保护性，要考虑不同的毒株删除的基因不同或者对同一毒株同时删除几个基因。

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所构建的ASF基因缺失弱毒株HLJ/18-7GD，缺失7个基因，在SPF猪、商品猪和怀孕母猪体内进行试验后毒力被减弱，不能转为强毒株。当猪只被致命的ASFV攻击时，该弱毒株（HLJ/18-7GD）为猪提供了完全保护。该疫苗具有较好的保护性和安全性，有望在控制ASFV传播方面发挥重要作用［16］。

2.3 传代培养弱毒株疫苗

ASFV在细胞内传代培养后，致病性大大减弱，这为ASF疫苗的成功研制带来了新的希望。ASFV经Vero细胞传代培养后致病性逐渐减弱，但抗原性和稳定性也发生了改变，经多次传代培养的毒株免疫猪后，并没有产生有效的抗体。但实验室研制的ASFV弱毒株（血清Ⅰ型：LK-111株、Katanga-350株；血清Ⅱ型：KK-202株；血清Ⅲ型：MK-200株；血清Ⅳ型：FK-32/135株；血清Ⅴ型：TSP-80/300株；血清Ⅵ型：TS-7/230株；血清Ⅶ型：UK-50株；血清Ⅷ型：RK-30株）经猪骨髓细胞传代培养后接种猪，对强毒株的攻击可以提供有效的保护［17］。

ASFV传代培养弱毒株是未来有望推向市场的候选方向之一，俄罗斯研制的传代细胞适应株（Arriah CV-1株）被欧盟作为未来重点研究的候选株［18］。

3 亚单位疫苗

亚单位疫苗是最安全的特异性抗原疫苗。研究表明，ASFV结构蛋白基因p30、p54、p72、pp62和膜蛋白基因CD2v具有良好的抗原性，能够参与病毒感染的多个阶段，构建的亚单位疫苗能够促进机体产生免疫应答，但对于强毒株的攻击保护作用较弱。

p54和p30结构蛋白分别参与病毒的吸附和内吞作用，两者能够诱导机体产生病毒中和抗体。用p54或p30抗原免疫猪并不能产生保护作用；用p54和p30抗原同时免疫猪可以延迟临床症状的出现，6头免疫猪中的3头免受E75毒株的攻击；杆状病毒表达的p54、p30融合蛋白免疫猪，对于E75毒株的攻击可产生保护性作用［19］；该病毒表达的p54、p30、p72蛋白免疫猪虽然可以使机体产生抗体，但对于Pr4株不能提供保护作用［20］。

ASFV粒子的复杂性和细胞内外两种感染形式导致难以产生有效的病毒中和抗体。也许识别抗原的中和表位与非中和表位有利于设计更有针对性的免疫反应提高疫苗的保护性。

4 DNA疫苗

研究表明，ASFDNA疫苗能够诱导产生细胞介导的CTL免疫反应，具有良好的开发潜力。

ASFDNA疫苗在大动物体内具有较差的免疫原性，将编码ASFV的2个基因（pCMV-PQ）的DNA疫苗免疫猪，实验猪并未产生免疫反应，该DNA疫苗却能诱导小鼠产生免疫反应。将该DNA疫苗融合编码ASF白细胞抗原2的基因片段，可以增强猪的免疫反应，但对于强毒株的攻击仍不能提供保护作用［21］。

将重组蛋白pCD2-E、重组质粒pcDNA312R共同免疫猪后，在体内可刺激机体产生IFN-γ，但对于强毒株Arm07的攻击并无保护作用［22-23］。将编码ASFV胞外区HA与p54、p30的基因片段构建DNA疫苗，虽然增强了猪的体液和细胞应答，但没有保护能力［24］。将泛素基因和p54、p30基因共同免疫猪后，可以诱导强烈的CD8+T细胞应答，即使没有特异性抗体存在也能提供部分保护，说明DNA疫苗可通过修饰携带的抗原增强细胞免疫应答［25-26］。也有研究表明，NK细胞和CD8+T细胞在ASFV攻击时起到了重要的保护作用。进一步的研究可以考虑在抗体介导的保护反应和细胞介导的保护反应中建立一种关联。

5 病毒活载体疫苗

用腺病毒、伪狂犬病病毒、牛痘病毒或者新城疫病毒作为载体构建的疫苗，可以更好地刺激细胞免疫和CTL效应［27-29］，但其免疫保护效力需要进一步评价。

Chen等［30］通过反向遗传学构建并表达了ASFV p72蛋白的重组新城疫病毒，并在小鼠模型中评估其体液和细胞免疫原性。用rNDV p72免疫小鼠时产生了高滴度的特异性的IgG抗体，并诱导T细胞增殖和分泌干扰素-γ、白细胞介素-4，该疫苗对猪的保护作用有待进一步研究。以腺病毒为载体表达的多种抗原（p32、p54、p72、pp62）免疫野猪后，诱导强烈的IgGs、IFN-γ、CTL反应，但对于ASFV-Georgia2007/1株的鼻内攻击，并不提供保护作用［31］。

6 小结与展望

研究人员虽然在ASF疫苗的研发上付出了很大的努力，但在上市之前仍然有很多问题需要解决。ASF灭活疫苗已被证明是无效的［4-5］。开发有效的亚单位疫苗需要寻找特定的保护性病毒抗原，以及合适的抗原传递系统免疫动物。减毒活疫苗虽然可以引起强而持久的免疫反应，但该疫苗的安全性亟待解决，包括它的副作用（皮肤损伤、关节肿胀等）和在农场传播的可能性；减毒活疫苗的另一个问题是缺乏稳定的生产细胞系，因为ASFV优先在原代单核细胞/巨噬细胞中复制。与亚单位疫苗、减毒活疫苗相比，DNA疫苗具有副作用少安全性高的优点，但具有较差的免疫原性，虽然能刺激机体产生免疫反应但不能提供免疫保护作用。

目前，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所构建的ASF弱毒疫苗（HLJ/18-7GD株）遗传稳定，接种后对育肥猪无不良影响，对田间商品猪保护率在80%以上；由于繁殖母猪生产周期为3～5年，对繁殖母猪的影响有待进一步观察。该疫苗限于全进全出商品育肥猪，暂不用于繁殖用的母猪及种公猪［32］。该疫苗有望成为商品疫苗预防ASF。