马阴道微生态制剂的制备工艺研究

张 昱，苏少锋，常 嵘，白 娜，张子玉，张泽云，张振奇，朱崇瑶，程 超

（1.集宁师范学院生命科学与技术学院，内蒙古 集宁区 012000；2.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特010031）

阴道是一个复杂、动态的微生态体系。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）在阴道微生物菌群中占主导地位，因其能够抑制病原体增殖，被认为是健康阴道微生物菌群中的优势物种［1］。乳酸菌的存在是评价阴道健康水平的重要指标之一，而缺乏乳酸菌会破坏阴道微生物菌群平衡，降低免疫屏障功能，继而引发由细菌、真菌和衣原体感染以及寄生虫病等［2］。蒙古马作为我国的优秀马种之一，遗传、育种、繁殖与生殖健康息息相关。生殖健康水平与蒙古马的受胎率、产肉量、产奶量、饲料消耗量等密切相关，影响马养殖业的生产效率和经济效益，对现代马产业的健康发展具有决定性作用。目前，兽医临床针对马生殖道疾病的治疗手段主要是抗生素疗法和中药疗法。抗生素治疗可明显改变马生殖道内的微生态环境，造成菌群种类失调，进而导致治疗效果不佳、复发率高等问题。中药以其低毒性、不易产生病原微生物耐药性等优点被广泛应用，但存在治疗周期长、见效缓慢等缺点。

微生态制剂是运用微生态学原理，将对宿主有益无害的益生菌或益生菌促生长物质经特殊工艺制成的制剂。微生态制剂因无残留、无耐药性、无毒副作用、效果显著、不污染环境等优点成为抗生素的理想替代品，可减少畜禽产品中的药物残留和耐药性有害菌的污染，目前被应用于饲料、农业、医药保健和食品等领域［3］。微生态制剂研究更侧重菌种的筛选及开发，生产工艺复杂，制备环节技术要求较高［4］。当前，市售动物用微生态制剂产品的质量品质及效果良莠不齐，为了进一步推动动物用微生态制剂的生产和发展，需要优化生产工艺，提高生产质量［5］。该研究以前期从健康母马阴道内分离筛选的优势乳酸菌菌株为研究对象，对微生态制剂制备工艺的关键参数进行优化，以期为确定最佳的治疗马阴道炎症微生态制剂的制备工艺提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri），由内蒙古自治区农牧业科学院研究团队从健康蒙古马母马阴道中分离、鉴定并保存。

1.1.2 主要试剂

淀粉、微粉硅胶、微晶纤维素、乳糖、蔗糖、葡萄糖、大豆胨、酵母粉、胰酪蛋白胨，购自江苏联瑞新材料股份有限公司。

1.1.3 主要仪器设备

多功能药用机，型号：DGN-Ⅱ，购自上海辰环机械制造有限公司；真空冷冻干燥机，型号：SCIENTZ-10YG/A，购自宁波新芝冻干设备有限公司；发酵设备，型号：KRH-PJ-50L，购自镇江东方生物工程设备技术有限责任公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌粉制备工艺

1.2.1.1 菌株发酵培养基优化

采用Box-Behnken试验设计，以不同碳源（乳糖、蔗糖、葡萄糖）以及不同氮源（大豆胨、酵母粉、胰酪蛋白胨）为因素，以活菌数及存活率为响应值，运用Design-Expert软件进行分析，筛选出最佳的菌株培养基。碳源对格氏乳杆菌发酵性能影响的响应面试验因素水平设计见表1，氮源对格氏乳杆菌发酵性能影响的响应面试验因素水平设计见表2。

表1 碳源响应面试验因素设计 单位：%

表2 氮源响应面试验因素设计 单位：%

1.2.1.2 菌株发酵工艺参数优化

采用单因素法测定不同工艺参数下格氏乳杆菌的活菌数以及存活率，确定菌株发酵的最佳工艺参数。

1.2.1.2.1 不同初始pH值对格氏乳杆菌生长发酵性能的影响

将格氏乳杆菌接种于初始pH值为6.0、6.3、6.6、6.9、7.2经优化的液体培养基，37℃厌氧培养24 h，测定发酵液终点活菌数。试验重复3次，结果取平均值。

1.2.1.2.2 不同培养温度对格氏乳杆菌生长发酵性能的影响

将格氏乳杆菌接种于温度为34、37、40℃经优化的培养基，厌氧培养24 h，测定发酵液终点的活菌数。试验重复3次，结果取平均值。

1.2.1.2.3 不同接种量对格氏乳杆菌生长发酵性能的影响

将格氏乳杆菌按2%、4%、6%、8%、10%的量接种于经优化的培养基，37℃厌氧培养24 h，测定发酵液终点的活菌数。试验重复3次，结果取平均值。

1.2.1.3 菌粉制备

将格氏乳杆菌接种于经优化的液体培养基，以优化的工艺参数进行厌氧培养至终点，离心弃去上清液，加入脱脂乳搅拌均匀，置于真空冷冻干燥机中进行真空冷冻干燥，将干燥好的菌粉粉碎，置于-20℃冰箱中保存。

1.2.2 微生态制剂制备工艺

1.2.2.1 辅料配比优化

采用Box-Behnken试验设计，以淀粉、微晶纤维素、微粉硅胶为因素，以活菌数为响应值，运用Design-Expert进行分析，确定辅料最佳配比。辅料优化响应面试验因素设计见表3。

表3 辅料优化响应面试验因素设计 单位：%

1.2.2.2 设备工艺参数优化

在超净台内准确称量格氏乳杆菌菌粉与上述优化配比的辅料进行混合，放入多功能药用机物料斗，以10、20、40 r/min的转速，以30°、45°、60°的不同角度混合，待混合好后从物料斗内不同位置取3个样本，进行活菌数检测，确定多功能药用机在制剂制备过程中最佳的工艺参数。

1.2.2.3 微生态制剂制备

根据上述优化的制剂工艺参数进行微生态制剂制备。

1.3 数据统计与分析

采用SPSS20.0和GraphPad Prism6软件进行方差分析及制图。P<0.05表示达到显著水平，P<0.01表示达到极显著水平。

2 结果与分析

2.1 菌粉制备工艺参数的优化

2.1.1 碳源的确定

碳源各因素经过拟合得到的回归方程均为二次多项式回归模型方程。

发酵液活菌数的回归方程为：Y=10.70-0.18X1-0.21X2+2.97X3+0.17X1X2+0.017X1X3-0.15X2X3-2.21X12-0.28X22+2.60X32。

菌粉活菌数的回归方程为：Y=456.22-0.85X1-3.63X2+50.78X3-0.25X1X2-1.45X1X3-10.50X2X3-116.21X12-43.26X22+34.54X32。

冻干存活率的回归方程为：Y=48.34+0.80X1+0.72X2-5.07X3-0.60X1X2-0.13X1X3-0.26X2X3-3.42X12-3.67X22-4.88X32。

Design Expert软件进行的ANOVA分析表明P<0.05，模型是显著的。发酵液活菌数回归模型的决定系数为0.459 2，菌粉活菌数回归模型的决定系数为0.756 0，冻干存活率回归模型的决定系数为0.859 2，说明该模型拟合程度良好，可用该模型分析与预测最佳碳源配比。

利用Design Expert软件进行二次多元回归拟合，得到的二次回归方程的响应面见图1。

图1 碳源二次回归方程响应面图

通过回归系数绝对值大小分析不同碳源对发酵液活菌数、菌粉活菌数、冻干存活率的影响，利用Design-Expert软件进行试验结果优化。结果表明，3种碳源对格氏乳杆菌发酵性能影响大小依次为：乳糖（1.366%）>蔗糖（0.674%）>葡萄糖（0.672%）。由此可见，乳糖对格氏乳杆菌发酵性能影响最大。

2.1.2 氮源的确定

氮源各因素经过拟合得到的回归方程均为二次多项式回归模型方程。

发酵液活菌数的回归模型方程为：Y=5.41+0.70X1+0.62X2-2.500E-003X3+0.29X1X2+0.10X1X3-0.060X2X3。

菌粉活菌数的回归模型方程为：Y=225.80+21.25X1+15.13X2-1.88X3+8.00X1X2+5.00X1X3+1.25X2X3-19.28X12-9.03X22-11.02X32。冻干存活率的回归模型方程为：Y=47.69-0.88X1-1.63X2-0.41X3-0.45X1X2+0.27X1X3+0.80X2X3-2.88X12-2.29X22-3.60X32。

利用Design Expert软件进行ANOVA分析表明P<0.05，模型是显著的。发酵液活菌数回归模型的决定系数为0.921 3，菌粉活菌数回归模型的决定系数为0.891 7，冻干存活率回归模型的决定系数为0.884 4，说明该模型拟合程度良好，可用该模型分析与预测最佳氮源配比。

利用Design Expert软件进行二次多元回归拟合，得到的二次回归方程的响应面见图2。

图2 氮源二次回归方程响应面图

通过回归系数绝对值大小分析不同氮源对发酵液活菌数、菌粉活菌数、冻干存活率的影响，利用Design-Expert软件进行试验结果优化。结果表明，3种氮源对格氏乳杆菌发酵性能影响大小依次为：大豆胨（0.626%）>胰酪蛋白胨（0.614%）>酵母粉（0.504%）。由此可见，大豆胨对格氏乳杆菌发酵性能影响最大。

2.1.3 初始pH值的确定

由图3可知，初始pH值为6.6时格氏乳杆菌发酵活菌数最高。

图3 不同初始pH值对格氏乳杆菌生长发酵性能的影响

2.1.4 培养温度的确定

由图4可知，40℃时格氏乳杆菌发酵活菌数最高。

图4 不同培养温度对格氏乳杆菌生长发酵性能的影响

2.1.5 接种量的确定

由图5可知，当接种量为6%时格氏乳杆菌生长发酵活菌数最高。

图5 不同接种量对格氏乳杆菌生长发酵性能的影响

2.2 微生态制剂制备工艺参数的优化

2.2.1 辅料配比的确定

采用Design-Expert软件对试验数据进行ANOVA分析，不同辅料因素经过拟合得到的回归方程为二次多项式回归模型方程： Y=70.80+3.25X1+2.88X2-1.38X3+0.25X1X2-1.25X1X3+4.50X2X3-13.90X12-8.15X22-1.65X32。

利用Design-Expert软件对试验数据进行的ANOVA分析表明P<0.05，模型是显著的，回归模型的决定系数为0.7668，说明该模型拟合程度良好，可用该模型分析与预测最佳辅料配比。通过F检验判定模型的准确性，该模型的P值<0.000 1，表明该模型在99%水平上显著；其失拟值为0.458 6>0.05，未达到显著水平，表明模型较准确。

由图6可知，淀粉的添加量不变，活菌数随微晶纤维素接种量的增加而增加，当接种量超过0.8%时，活菌数开始下降。

图6 微晶纤维素和改性淀粉对格氏乳杆菌活菌数的影响

由图7可知，微粉硅胶的添加量不变，随着微晶纤维素接种量的增加，活菌数先增加后降低，该图中活菌数可取到最大值。等高线为椭圆形，说明温度与接种量的交互作用显著。

图7 微晶纤维素和微粉硅胶对格氏乳杆菌活菌数的影响

由图8可知，微粉硅胶的添加量不变，随着淀粉接种量的增加，活菌数先升高后降低。等高线为椭圆形，说明淀粉与微粉硅胶的交互作用显著。

图8 微粉硅胶和改性淀粉对格氏乳杆菌活菌数的影响

利用Design-Expert软件进行试验结果优化，得到优化结果为：当微粉硅胶添加量为0.952%、微晶纤维素添加量为0.59%、淀粉添加量为98.56%时，格氏乳杆菌活菌数可达最高。

2.2.2 多功能药用机转速的确定

由表4可知，多功能药用机在转速为20 r/min时，格氏乳杆菌的活菌数比在其他两个转速下制备制剂显著升高（P<0.05），说明该条件下的工艺参数为最佳混匀工艺参数。

表4 转速对制剂活菌数的影响（n=3，X±S）

2.2.3 多功能药用机混合角度的确定

由表5可知，多功能药用机在混合角度为60°时，格氏乳杆菌的活菌数比在其他两个转速下制备制剂显著升高（P<0.05），说明该条件下的工艺参数为最佳混匀工艺参数。

表5 混合角度对制剂活菌数的影响结果（n=3，X±S）

3 讨论

蒙古马分娩后，子宫颈处于扩张状态，环境、皮肤和粪便中的病原微生物从生殖道进入子宫，引发蒙古马产后子宫内膜炎，从而导致繁殖率降低、产肉和产奶量下降，造成严重的经济损失，影响蒙古马养殖业的高质量发展［6］。目前，传统治疗母马生殖道疾病的方法是抗生素疗法，但抗生素在杀死病原菌的同时，抑制了正常菌群的增殖，为致病性耐药菌株提供了生长环境，因此，生产中急需新型药物的开发。

乳酸菌是阴道中重要的优势菌群，在保障生殖健康方面发挥着重要作用［7］。阴道乳酸菌在奶牛、猪、犬、大鼠、小鼠、兔、仓鼠、绿长尾猴等动物中均有研究。乳酸菌在母马阴道中同样分布广泛，对生殖道炎症有明显的缓解作用［8］。微生态制剂因无残留、无耐药性、无毒副作用、效果显著、不污染环境等优点成为抗生素的理想替代品，可减少畜禽产品中的药物残留和耐药性有害菌的污染。微生态制剂类产品用于动物疾病，重在预防，可以最大限度地发挥动物的生产潜能［9］。

该研究针对前期从健康母马阴道内分离筛选的优势乳酸菌菌株，利用发酵学方法及药物制备学技术，将菌株的菌粉及制剂配方和工艺参数优化出来，并根据优化的配方及工艺参数制备预防和治疗马体阴道炎症的微生态制剂，为马体阴道炎症微生态制剂的制备提供理论基础。