基于网络药理学探讨黄葵胶囊治疗糖尿病肾病的作用机制

吴秀兰，王富江，葛海涛,*

（1. 南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210023；2. 江苏苏中药业研究院有限公司，江苏 南京 210031）

糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy，DN）是糖尿病最主要的微血管疾病之一，严重威胁人类的健康。据报道，20% ～ 30%的糖尿病患者在患病5年或更长时间后容易发展为糖尿病肾病[1-3]。高血糖、高血压、肥胖、久坐不动的生活方式以及遗传等众多因素都可导致糖尿病肾病的发生及发展[4]。目前，临床主要通过控制血糖、血脂和血压治疗糖尿病肾病，但治疗效果不佳，常伴随着复发的风险[5]。

黄葵胶囊是治疗肾病的专用药物，与血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂等化药相比，黄葵胶囊在降低患者尿蛋白、延缓肾损害方面具有独特优势。研究表明，黄葵胶囊能明显改善慢性肾病患者24 h尿蛋白定量、血肌酐和尿素氮等，在治疗糖尿病肾病、慢性肾炎等方面疗效肯定，临床价值被评为A类[6]。黄葵胶囊含黄酮类、多糖、有机酸、核苷等化学成分，主要通过抑制免疫反应、抗炎、改善肾纤维化、保护肾小管上皮细胞等途径发挥药理作用[7-10]，但目前尚不清楚有效成分如何作用于靶蛋白和调节信号传导通路，从而达到抗炎和抗糖尿病的药理作用。本研究以黄葵胶囊中治疗糖尿病肾病的药效成分为研究对象，运用网络药理学的研究方法，构建“药物-成分-靶点-通路”网络关系，探索黄葵胶囊治疗糖尿病肾病的药效物质基础及潜在分子机制，并采用动物实验验证其对核心靶点的调节作用，为其临床使用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 数据库及软件 TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）、GeneCards（https://www.genecards.org/）、PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、微 生信 网 站（http://www.bioinformatics.com.cn/）、STRING（https://www.string-db.org/）、Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）、Uniprot（https://www.uniprot.org）、Cytoscape（3.7.1）、Metascape（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）等。

1.1.2 实验动物 SPF级雄性KM小鼠35只，体质量为20 ～ 22 g，实验动物许可证号SCXK（辽）2020-0001，伦理编号SZSW-2022041504（由辽宁长生生物技术股份有限公司提供）。

1.1.3 实验仪器 Dimension EXL200型全自动生化分析仪（德国西门子公司）；DM75M型倒置显微镜（德国Leica 公司）。

1.1.4 试剂与试药 链脲佐菌素（批号：C2019162）购于aladdin公司；兔抗血管内皮生长因子A（VEGFA）多克隆抗体（货号：ab46154）、抗小鼠信号转导与转录激活子3（STAT3）多克隆抗体（货号：ab68153）、兔抗小鼠肿瘤坏死因子（TNF-α）多克隆抗体（货号：ab215188）均购于英国Abcam公司；黄葵胶囊（批号：20091805）均购于江苏苏中药业集团股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黄葵胶囊治疗糖尿病肾病的靶点预测 通过Web of Science、Pubmed、CNKI等数据库检索黄葵胶囊的化学成分，筛选出文献已报道的活性成分。将获取的活性成分英文名称输入PubChem数据库，找到该成分的sdf结构，并将该结构导入Swiss Target Prediction数据库，预测其潜在靶点，Uniprot数据库对蛋白名称进行规范化。

将“Diabetic Nephropathy”作 为 关 键 词 输 入GeneCards数据库，消除重复性基因，并使用中位数法筛选出合适的基因数。将以上两者靶点去除重复值后导入微生信网站，在线分析黄葵胶囊治疗糖尿病肾病的作用靶点。

1.2.2 黄葵胶囊-糖尿病肾病关键靶点的筛选运用STRING对共有靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用网络构建（Protein-Proteininteraction，PPI），选择物种为“Homo sapiens”,蛋白相互作用综合得分＞0.4。将PPI导入Cytoscape （3.7.1），根据网络拓 扑 学 性 质，以中 心 度 值（betweenness bentrality）、亲中心度值（closeness centrality）、等级值（degree）对PPI中的关键靶点进行筛选。

1.2.3 基因本体及京都基因与基因组百科全书富集分析 将作用靶点导入Metascape数据库，以P值为0.01对作用靶点进行富集分析，并使用微生信在线作图分析网站对富集分析结果进行可视化。

1.2.4 “药物-成分-靶点-通路”网络构建与分析

将黄葵胶囊治疗糖尿病肾病的靶点及信号通路分别导入Cytoscape软件，构建网络图并利用网络分析功能对网络图的特征进行分析。黄葵胶囊有效成分与治疗DN的靶点相关联， 同时映射到相关通路中，通过“药物-成分-靶点-通路”网络图探讨黄葵胶囊治疗DN的作用机制。

1.2.5 分组及造模 取体质量为20 ～ 22 g的SPF级雄性KM小鼠35只，在温度（19±3）℃、湿度50%～70%，12 h光照/12 h黑暗交替的条件下，适应性饲养一周。随机选取10只作为正常组，给予常规清洁级饲料。其余25只小鼠全部造模，腹腔注射（ip）链脲佐菌素以0.025 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH = 4.4）配制100 mg/kg连续注射3 d，3 d后于尾静脉连续采血2次，以血糖≥16.7 mmol/L者为合格。造模过程中小鼠给予高脂饲料饲养4周，期间有3只小鼠死亡。造模结束时，开始用代谢笼收集小鼠24 h尿液，以全自动生化分析仪检测小鼠24 h尿蛋白定量、肌酐，以血糖水平≥16.7 mmol/L、尿蛋白阳性，作为糖尿病肾病动物模型建立标准。2只小鼠尿蛋白呈阴性，剔除。将造模成功的小鼠随机分为模型组、黄葵胶囊组，每组10只。黄葵胶囊组灌胃（ig）黄葵胶囊，正常组和模型组灌胃（ig）等体积生理盐水，每天1次，连续4周。每日观察各组小鼠的精神状态、饮食、饮水以及皮毛色泽变化等情况。分别于DN小鼠模型成模前后及给药期间，定期检测全部小鼠体质量。给药结束后，收集全部小鼠尿液。用戊巴比妥钠麻醉后，眼球取血，静置1 h后离心（3 000 r/min，4℃，10 min），分装血清冻存。

1.2.6 肾组织病理学 取左、右侧肾脏用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，分别进行HE、PAS染色，显微镜下观察肾组织病理变化情况。

1.2.7 免疫组化 采用免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）SP 法定性分析各组小鼠VEGFA、TNF-α、STAT3的表达特征。组织切片常规脱蜡，梯度乙醇入水，抗原用柠檬酸缓冲液修复，蛋白一抗抗小鼠信号转导与转录激活子3（STAT3）多克隆抗体、兔抗小鼠肿瘤坏死因子（TNF-α）多克隆抗体、兔抗小鼠β-肌动蛋白（β-actin）（内参）多克隆抗体、兔抗血管内皮生长因子A（VEGFA）多克隆抗体）浓度均为 1∶ 200，4 ℃孵育，过夜，37 ℃复温。二抗［辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）］标记的山羊抗兔疫球蛋白G（IgG）抗体，浓度为1∶1 000，37 ℃孵育，30 min，洗涤，DAB 显色，苏木素轻度复染，脱水、二甲苯透明、树脂封片。每张切片从肾皮质外侧向内，自上而下随机取5个高倍（×200）视野，观察阳性细胞分布情况，并用 Image J图像分析软件进行半定量分析。VEGFA、TNF-α、STAT3蛋白表达以平均吸光度（累积吸光度/测量面积）表示。

1.2.8 统计学方法 用 Graphpad Prism 8.0.2软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 黄葵胶囊活性成分靶点预测

通过文献查阅，黄葵胶囊活性成分有19种，包括11种黄酮类成分、3种核苷以及5种有机酸，靶点共273个，并建立“成分-靶点”网络，见表1、图1。

图1 黄葵胶囊活性成分-靶点网络Fig. 1 Active ingredients - target network of HKC

表1 黄葵胶囊活性成分及靶点相关信息Tab. 1 Relevant information of active components and targets of Huangkui capsule

2.2 PPI网络构建及关键靶点筛选

PPI网络图中含有125个靶蛋白（2个靶蛋白未参与蛋白互）和1 700条互作边。利用拓扑参数betweenness bentrality＞0.001 8、closeness centrality＞0.53、degree＞21筛选出关键靶点47个，见图2。该PPI网络中，节点按degree值排列，节点越大，作用的基因数目越多，相关性越大；连接线按combined-score排列，连接线越粗，相关性越大。评分较高的核心靶点有EGFR 、CASP3、ALB、SRC、HIF1A、GAPDH、VEGFA、TNF、STAT3等。

图2 黄葵胶囊治疗DN核心靶点网络Fig. 2 The key targets network of HKC in the treatment of DN

2.3 基因功能和通路分析

对127个靶点进行GO以及KEGG通路注释分析，按显著性程度对GO前10条分析结果（见图3）以及KEGG前20条通路（见图4）进行展示，GO富集分析主要涉及激素的反应、激酶活性的调节、细胞因子的调节等生物过程，以及蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白质结构域特异性结合、磷酸酶结合、胰岛素受体底物结合等分子功能。KEGG富集分析包括晚期糖基化产物（AGE-RAGE）信号通路、PI3KAkt 信号通路、低氧诱导因子（HIF-1）信号通路、MAPK信号通路、Ras信号通路、VEGF信号通路等。

图3 BP-CC-MF柱状图Fig. 3 Biological Process（BP）-Cell Composition （CC）-Molecular Function （MF） histogram

图4 KEGG富集分析气泡图Fig. 4 Bubble chart of KEGG enrichment analysis

2.4 “药物-成分-靶点-通路”网络分析

使用Cytoscape（3.7.1）构建了“药物-成分-靶点-通路”网络分析，见图5。该网络通过多个靶点建立了药物、成分与通路之间的联系，包括10种活性成分、6条关键KEGG信号通路等。对网络中各化合物作用通路进行分析，黄葵胶囊治疗糖尿病肾病以槲皮素、异槲皮苷、杨梅素、咖啡酸为主要活性成分，作用于微血管、炎症及免疫相关靶点，并通过不同的代谢途径和生物过程，共同调节机体水平。

图5 “药物-成分-靶点-通路”网络分析Fig. 5 “HKC - ingredients - targets - pathway” network

2.5 动物验证

2.5.1 黄葵胶囊对糖尿病肾病小鼠尿蛋白及肌酐的影响 与正常组对比，模型组小鼠UCFP、ACR水平明显升高（P＜ 0.05），结合血糖测量值，糖尿病肾病模型建立成功；与模型组相比，经黄葵胶囊治疗4周后，小鼠体内UCFP、ACR水平明显降低（P＜0.05），见图6。表明黄葵胶囊能明显改善糖尿病肾病小鼠肾功能。

图6 各组小鼠UCFP 、ACR 变化（n = 10）Fig. 6 UCFP and ACR for mice in various groups（n = 10）

2.5.2 黄葵胶囊对糖尿病肾病小鼠肾组织病理学分析 正常组小鼠肾小球、肾小管或间充质均未见明显的组织病理学改变,肾脏组织结构基本完整；而模型组小鼠肾小球系膜扩张，基底膜增厚，皮质部肾小管上皮细胞重度坏死，说明模型组小鼠肾组织出现了病理性损伤；黄葵胶囊治疗后，小鼠肾组织病理损伤均有不同程度的减轻。PAS 染色显示：模型组小鼠糖原沉积，系膜扩张、肾小管空泡变性。黄葵胶囊治疗后，模型组小鼠肾组织糖原累积及系膜扩张程度明显降低，见图7。

图7 黄葵胶囊对糖尿病肾病小鼠肾组织病理变化的影响（×200）Fig. 7 Effect of HCK on renal pathological changes in DN mice （×200）

2.5.3 黄葵胶囊对糖尿病肾病小鼠肾组织VEGFA、TNF-α、STAT3蛋白表达的影响 TNF-α、STAT3是免疫和炎症的关键蛋白，是发生炎症反应的重要信号因子。与正常组相比，VEGFA、TNF-α在模型组中表达上调（P＜0.05），STAT3的表达上调，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组相比，黄葵胶囊治疗组中VEGFA、TNF-α蛋白明显下调（P＜0.05），STAT3蛋白下调，但差异无统计学意义（P＞0.05），见图8。

图 8 各组小鼠肾组织VEGFA、TNF-α、STAT3蛋白表达的影响Fig. 8 Renal tissue protein expressions of VEGFA, TNF-α and STAT3 in mice in various

3 讨论

研究结果表明，黄葵胶囊通过VEGFA、STAT3、TNF、HIF1A、GAPDH等多基因共同表达，AGERAGE信号通路、PI3K-Akt 信号通路、低氧诱导因子（HIF-1）信号通路、MAPK信号通路、Ras信号通路、VEGF 信号通路等多条通路调控，发挥对DN的治疗作用。在DN等肾脏疾病早期时，VEGFA在足细胞中表达水平升高，而在DN晚期时，由于足细胞凋亡，VEGFA表达水平下降，抑制足细胞中VEGFA的表达可改善蛋白尿，但由于VEGFA能保护微血管，完全抑制VEGFA表达，则加重肾小球损害[11-17]。信号转导与STAT3，是免疫和炎症的关键蛋白，STAT3磷酸化并入核，结合靶基因， 使IL-6产生增加，从而加重炎症[18]。STAT3蛋白表达越低，DN大鼠蛋白尿减少，肾小球系膜细胞增殖和系膜扩张减少，巨噬细胞浸润减少[19-20]。TNF具有免疫调节和促炎作用，TNF-α作为TNF家族的主要表达蛋白，刺激单核细胞和巨噬细胞聚集，引起ROS的产生，增加血管通透性，从而导致白蛋白的产生，进一步损害肾小球[21]。

为进一步探讨黄葵胶囊治疗DN的潜在分子机制，本研究利用动物实验证实了黄葵胶囊中的活性成分可通过下调VEGFA、TNF-α蛋白的表达，发挥治疗作用。但与正常组相比，DN小鼠STAT3无明显变化，HKC治疗后，STAT3蛋白具有上调趋势，但差异无统计学意义。已有研究证实，DN大鼠中STAT3总表达水平并不会明显上调， p-STAT3表达水平才会明显上调，从而使p-STAT3/ STAT3增大，敲除STAT3基因可明显降低炎症因子的表达，与本研究结果一致。根据本研究结果推测，黄葵胶囊可能通过下调VEGFA、TNF-α蛋白的表达，改善血液微循环、降低炎症反应，从而降低DN患者尿蛋白。

4 结论

网络药理学研究发现黄葵胶囊治疗糖尿病肾病关键靶点47个，可能与AGE-RAGE、PI3K-Akt 等信号通路相关。动物实验验证了黄葵胶囊能降低VEGFA、TNF-α蛋白的表达，从而降低糖尿病肾病小鼠尿蛋白。本研究存在一定局限性，仅仅通过动物实验验证了预测到的靶点，针对于黄葵胶囊中何种活性成分发挥作用，以及如何作用于相关靶点及通路，还需要结合分子对接技术以及细胞实验进行研究。