基于国家专利的中药复方调治肝癌用药规律及作用机制研究

黄锦桢，陈团团，张唤唤，赛俊婷，赖剑萍，童光东,2*

(1.广州中医药大学 第四临床医学院，广东 深圳 518033；2.深圳市中医院 肝病科，广东 深圳 518033)

肝癌有原发性与继发性之分，是一种常见的恶性肿瘤。其中，原发性肝癌的发病率及死亡率在我国分别位居恶性肿瘤的第五位与第二位，严重威胁着人民的生命健康[1-2]。目前早期肝癌的治疗首选手术切除, 中晚期则以介入治疗、放化疗、系统疗法为主，但这些往往会给病人带来胃肠道反应、皮疹、高血压等毒副作用，严重影响患者的生活质量[3]。因此，在西医常规治疗方案外，寻找一种可与之结合，互为补充的治疗方法十分必要。

中医讲究四诊和参、辨证论治、整体调理。通过合理的药味搭配，中药复方在抑制肝癌的同时，往往可有效缓解乏力、呃逆、腹水等症状，显著改善患者生存质量。而国家专利中药复方作为现代组方选药、新药上市的一个重要组成部分，多为医生长期用药智慧的汇聚、临床经验的结晶，具备较强的可重复性和适用性[4]。本研究将挖掘国家专利数据库中调治肝癌的中药复方专利数据，分析其用药配伍规律，并运用网络药理学初步研究其作用机制，为中医药治疗肝癌及新药开发提供参考。

1 资料与方法

1.1 数据来源

登录“国家知识产权局-中国专利公布公告”网（http://epub.sipo.gov.cn），在高级查询选项中同时勾选“发明授权”与“发明公布”，在“文本-名称”项目中分别以“肝癌and中药”“肝癌and草药”“肝细胞癌and中药”“肝细胞癌and草药”“胆管细胞癌and中药”“胆管细胞癌and草药”进行检索，对结果进行合并、筛选后得到最终结果。检索时间范围为建库至2021年10 月10 日。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①国家专利数据库中调治肝癌的口服中药复方专利，剂型不限；②国家专利数据库调治肝癌含中药提取物的专利；③专利项目名称未明确说明调治肝癌，但发明专利详情页中说明可调治肝癌。

排除标准：①非调治肝癌的专利；②调治肝癌的外用专利复方(外敷、膏药等)；③中西药物混合应用的专利复方；④食品、饮品、保健品类专利。

1.3 数据规范及录入

药物名称规范参照2020年版《中国药典》[5]和《中药大辞典》[6]，如“双花”更改为“金银花”，“旱莲草”更改为“墨旱莲”。若复方专利中药物组成相同但剂型、制备工艺相异，该药物组合仅录入1次。按照双盲录入原则展开数据录入并校对，把控 2 次数据结果相异率在1% 以下。

1.4 数据分析

运用SPSS 19.0软件进行药物频数统计和系统聚类分析，借助IBM SPSS Modeler 18.0 软件建模后实施Apriori 关联规则分析。

1.5 网络药理学

1.5.1 关键药物活性成分及相关靶点筛选 结合高频中药、药对、角药等结果，选取共有且排名最靠前的5味药物作为治疗肝癌的关键药物。并以OB≥30%、DL≥0.18为筛选条件，在TCMSP数据库（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）获取关键化学成分及对应靶点。

1.5.2 疾病靶点筛选 使用关键词“liver cancer”分别在Genecards及Disgenet数据库检索疾病靶点，因Genecards数据库中相关靶点过多，故以“Relevance score”的中位数为条件进行筛选，将得到的靶点汇总并去重。

1.5.3 KEGG富集分析 对药物与疾病的靶点取交集，将交集靶点上传至DAVID 6.7数据库（http://david. ncifcrf. gov/）进行 KEGG富集分析，限定人类为物种，以P＜0.05为条件进行筛选，结合文献筛选相关通路。

1.5.4 “关键药物-成分-靶点-通路”网络构建 挖掘前20条通路上各自富集的靶点，借助CytoScape 3.7.2软件构建 “关键药物-成分-靶点-通路”网络。根据靶点的网络拓扑参数，如：连接度、介度、紧密度等筛选核心靶点及活性成分。

2 结果与分析

2.1 中药专利公布情况

初步检索得到97项专利，筛选后得到91项，所纳入专利公布时段为2003年10月至2021年10月。

2.2 药物频数

91项专利共涉及药物348味，所纳入单项专利药味数最多为50味，最少为2味，平均（12 ± 8.46）味。高频药物有白花蛇舌草（31次，34.07%）、柴胡（31次，34.07%）、黄芪（25次，27.47%）、白术（24次，26.37%）、半枝莲（21，23.08%）等，见表1。统计所纳入中药的四气五味信息，结果表明复方专利干预肝癌的中药多归肝、肺、脾、胃经，性味以寒、苦居多，见图1。

表1 前30味高频药物Tab. 1 Top 30 high frequency drugs

图1 中药四气五味及归经统计Fig. 1 Radar chart of four nature, five flavors and meridian attribution of TCM

2.3 中药的关联分析

运用Apriori 模型分析91项专利的药物组合，设置条件支持度≥10%，规则置信度≥50%，最大前项数设定为2，结果得出：最大支持度34.07%，最小支持度13.19%，支持度越高，对应药物出现频率越高。支持度前10的药对及角药组合，见表2、表3。

表2 中药二项关联分析（支持度前10）Tab. 2 Second order analysis table of TCM （top 10 of support）

表3 中药三项关联分析（支持度前10）Tab. 3 Third order analysis table of TCM（top 10 of support）

2.4 聚类分析

对30味高频中药进行系统聚类分析，分析结果及药物组合见图2。当欧式距离平方为19时，可得到6项聚类结果，其中药物大于2味的有5项，见表4。

图2 药物聚类分析树状图Fig. 2 Dendrogram of drug cluster analysis

表4 高频中药聚类分析结果Tab. 4 Results of cluster analysis of high frequency TCM

2.5 网络药理学

2.5.1 活性成分及相关靶点 结果共筛选白花蛇舌草、柴胡、黄芪、白术、半枝莲这5味中药为关键药物；在TCMSP 数据库上检索并汇总去重后，最终得到活性成分共70种，相关靶点202个。

2.5.2 疾病靶点 在GeneCards数据库检索并以Relevance score≥2.25筛选后得8 403个疾病靶点，Disgenet数据库检索到靶点1 395个，两者去重后共得到8 650个靶点。

2.5.3 KEGG通路分析 药物与疾病的靶点取交集后共有184个靶点，见图3。富集分析共得到KEGG通路126条，结合文献对所得通路进行筛选，见图4。

图3 高频药物及疾病靶点韦恩图Fig. 3 Venn diagram of high frequency drugs and disease targets

图4 前20条KEGG相关通路气泡图Fig. 4 Bubble diagram of the first 20 KEGG-related pathways

2.5.4 “关键药物-成分-靶点-通路”网络图的构建 借助软件构建“关键药物-成分-靶点-通路”网络图，见图5。对网络图节点的连接度、介度及紧密度等参数进行分析，结果表示化学成分前四位是quercetin（槲皮素）、kaempferol（山柰酚）、luteolin（木犀草素）和wogonin（汉黄芩素），蛋白靶点前四个是PTGS2、PTGS1、NCOA2和PRSS1，将上述筛选为关键成分及靶点，见表5。

表5 核心成分及靶点相关参数Tab. 5 Core components and target related parameters

图5 “关键药物—成分—靶点—通路”网络图Fig. 5 Network diagram of "key drug-component-target-pathway"

3 讨论

近年来，数据挖掘与网络药理学在中医药领域的应用已成为中医药现代研究的一个新方法与新热点。应用大数据，可探讨中医药处方规律、中医药治疗疾病的多成分-多靶点-多通路等方面。大多数中医药处方用药规律研究的数据库来源是基于某位医师对某疾病的处方收集或者是某医书对某疾病的处方收集。与常规的数据库来源不同，本研究的处方数据库是来源于国家知识产权局专利库中的肝癌复方专利。中药专利处方是医生多年临床经验的结晶，是多数基础研究的根基，是经过专业机构认可的。因此，采用此数据库研究中药复方治疗肝癌的用药规律，既经得起临床的考验，又具有一定基础研究的佐证。

本研究共纳入专利91项，涉及药物348味。通过频次及关联分析，得到高频药物有白花蛇舌草、柴胡、黄芪、白术、半枝莲等。中医讲究辨证论治，处方用药与病因病机息息相关。肝癌的核心病机之一为毒热，热毒贯穿疾病始终，故临床上多用清热解毒类治疗肝癌[7]。正如《素问·至真要大论》云：“治热以寒，热者寒之”，高频药物白花蛇舌草和半枝莲正是清热解毒类药物，二药相须配伍，协同增效，发挥清热解毒、化瘀抗癌之效。同时，现代实验研究表明白花蛇舌草可通过增强小鼠机体的细胞免疫及体液免疫能力，使机体可有效的识别并清除肝癌细胞，从而抑制肿瘤血管生成[8]；半枝莲β-谷甾醇能增加荷瘤小鼠机体抗肿瘤细胞因子的分泌，减少免疫抑制因子的分泌，从而抑制肝瘤的进展[9]。正是基于上述功效，这二味常以药对形式出现在各类抗肿瘤的方剂中[10]，此药对也是本研究中频率最高的药对。肝癌起病隐匿，病程较长，久病必虚，耗伤正气；肝病日久，肝木克土，横逆犯脾，如《金匮要略》言：“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”。高频药物黄芪、白术可健脾益气，如《本草求真》称黄芪为“补气诸药之最”，《医学启源》言白术可: “除湿益燥，和中益气，温中等”。此二药相配，可健全后天脾胃之本，恢复人体正气以驱邪外出。同时，现代研究阐释了黄芪具有抗肿瘤、提高机体免疫力的作用[11]；白术可通过抑制细胞增殖和转移、诱导细胞凋亡以及抑制肿瘤新生血管生成等作用[12]。肝为刚脏，以血为体，以气为用，体阴而用阳。肝脏疾病常影响到肝脏疏泄功能，导致机体气机不畅，故常需配伍行气疏肝的中药，如高频药物柴胡。

从药物性味归经而言，复方专利的中药以苦寒为主，主入肝、肺、脾、胃经，这亦体现中医处方用药特色。苦寒以清热解毒，高频药物白花蛇舌草、半枝莲均为苦寒之品。肝气升发，肺气肃降，肝癌病位在肝，易致肝肺气机失衡，药物入肝肺经，可协调肝肺之气，维持人体气机之圆运动。肝属木，脾属土，肝脏受邪，肝木克土，多见脾胃症状，故临床治疗肝病需顾及脾胃，高频药物黄芪、白术均归脾胃经。

通过关联规则可知，复方专利常用的药对有半枝莲-白花蛇舌草、白术-黄芪、柴胡-黄芪等，置信度较高的角药组合有：白术-黄芪-白花蛇舌草、白术-黄芪-柴胡、黄芪-柴胡-白术等。这些药对、角药基本是临床常用的药味搭配，其功用多为清热解毒、健脾益气，与肝癌的虚、瘀的病机一一对应，适用于肝癌各种证型。如:“半枝莲-白花蛇舌草”组合清热解毒，适用于湿热毒结证型肝癌。“白术-黄芪”药对益气健脾，可用于脾虚湿困证型肝癌。

高频药物聚类分析共得出6项结果，以每类中多数药物的功效再划分，将此 6类分为清热解毒类（①、②）、疏肝健脾类（③）和活血化瘀类（④、⑤、⑥）。类①为以角药“白花蛇舌草、半枝莲、黄芩”以清热解毒；肝癌患者正气亏虚，气血津液不通，痰瘀稽留而成“癌毒”，药对“虎杖、桃仁”可活血祛瘀、润下通便，女贞子则以滋先天而养后天。类③为四君子汤和逍遥散合方化裁，该组合均出自《太平惠民和剂局方》，是指南[1]中“肝郁脾虚型”的推荐方。四君子汤具有补气，益气健脾之功效；逍遥散可调和肝脾，疏肝健脾。后天之本得固，气血生化有源，方能有正气存内、持久抗癌。类④为名方鳖甲汤加减，原方出自《圣济总录》，由鳖甲、桃仁、虎杖、大黄四味组成，功效化瘀下积，主治癖块腹满寒热。原方以鳖甲软坚散结，桃仁、虎杖、大黄三味活血化瘀、通下泻邪。临床上切忌通下过妄，类④在保留鳖甲汤的核心药物基础上，以药对“三棱-莪术”代替桃仁以活血化瘀，去虎杖减缓润下之效，增牡蛎软坚散结，加山慈菇清热散结。

在用药规律分析的基础上，进一步借助网络药理学的方法对关键药物治疗肝癌的作用机制进行探讨，并初步筛选出槲皮素、山柰酚、木犀草素和汉黄芩素为核心活性成分。有研究发现槲皮素可以下调肝癌细胞中MCL-1的表达来增强γδ T细胞对Huh7细胞的杀伤活性[13]；山柰酚能够诱导肿瘤细胞DNA损伤，而后者是肿瘤细胞化疗凋亡的主要机制[14]。孟欣等[15]研究发现木犀草素能够调节细胞促增殖、促凋亡基因及新生血管因子的表达；李美德等[16]研究发现黄芩素可下调癌症基因JUN、EGFR的表达及上调细胞周期调控因子的表达。因此推断高频药物可能是通过下调癌细胞中MCL-1、抑制癌细胞的基因、促癌基因的表达等发挥抑制癌细胞增殖与血管新生活力，从而起到抗肝癌作用。靶点方面，研究显示PTGS1的基础表达是可维持肝脏内环境所必须的，也可保护肝脏免受化学性肝毒性的损伤[17]；PTGS2可刺激癌细胞增殖，促进血管生成，PTGS2抑制剂可抑制人肝细胞癌的生长和诱导细胞凋亡[18-19]。研究表明丝氨酸蛋白1（PRSS1）在多种消化肿瘤中高表达，其可能参与了肿瘤的侵袭和转移[20]；核受体辅激活因子 NCOA2（又称Src-2），在肝肿瘤发生过程中，可发挥细胞自主肿瘤抑制作用[21]。故高频药物可能通过促进PTGS1 、NCOA2的表达与抑制PTGS2、PRSS1的表达起到抗癌作用。通路方面，筛选后相关的有Hepatitis B、TNF、HIF-1、T cell receptor 等通路。慢性病毒性肝炎是为肝癌最主要的原因，中国约有54%的肝癌是由HBV引起的[22]。相关研究也发现TNF、HIF-1、T cell receptor 通路与细胞凋亡、炎症反应、免疫应答密切相关，这些与肝癌疾病的进展密不可分[23-25]。

4 结论

本研究揭晓了复方专利调治肝癌有规可循，其基本大法以清热解毒、益气健脾、活血化瘀为主，辅以通下、疏肝、滋阴等，这契合肝癌的病机。在用药规律基础上，进一步采用网络药理学对作用机制初步探讨。不足之处为部分专利仅说明用药区间或未阐明复方的适用证型，故未能分析量效关系及对证型统计分析。后续将对名老中医经验进行深入研究及实验验证网络药理学的结果，以冀为治疗肝癌的临床用药提供参考，为临床研发治疗肝癌的新药奠定前期基础。