多花黄精根腐病对根际土壤细菌微生态的影响

韩 凤，章文伟，李巧玲，杨晓玉，林茂祥*

（1.重庆市药物种植研究所，重庆 南川 408435； 2. 重庆市道地药材规范化生产工程技术研究中心，重庆 南川 408435）

多花黄精Polygonatum cyrtonemaHua 为百合科Liliaceae 黄精属PolygonatumMill 多年生草本植物，以干燥根状茎入药，作为正品药材黄精收录于2020年版《中国药典》（一部）[1]，具有2 000多年药用历史和1 000多年栽培历史[2]。多花黄精主要含有多糖类、甾体皂苷类、黄酮类、生物碱类及木脂素类等活性成分，还含有大量氨基酸、微量元素等，现代研究表明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、降血糖、调血脂、提高免疫和改善记忆等药理作用[3]，临床用于治疗脾胃气虚、冠心病、糖尿病、高血脂、低血糖、慢性支气管炎、延缓动脉粥样硬化等多种病症[4]。多花黄精除了作药用，还因其极高的食用价值，被广泛用于食品和保健品等行业，开发价值大，市场前景较好。多花黄精主产于湖南、四川、贵州、安徽、福建、重庆等地[5]，因市场需求增加，多花黄精的种植规模逐年扩大，在生产实践中，随着种植年限增加，其叶片、茎干、根茎病害发生程度也逐年升高，尤其是根腐病的发病日益严重，从而导致其产量减少和质量降低[6-7]，对药农造成了严重损失。

微生物群落结构组成和多样性反映了土壤微生态的现状及变化趋势，它受土壤肥力、植物品种类型和种植方式等影响较大，还对土壤健康和病虫害的抑制起着重要作用[8-10]。中药材根腐病主要是由细菌、真菌和线虫等多种病原混合侵染引起的[11]，目前仍主要使用化学农药进行防治，而研究病、健植株根际土壤细菌群落结构的变化，探究根腐病与根际土壤细菌之间的关系，寻找有益细菌，对筛选根腐病生防菌具有重要意义。随着土壤微生物研究的不断深入，根际土壤微生物与植物病害之间关系成为研究热点。赖宝春等[12]研究表明辣椒患病植株根际土壤中的细菌多样性要低于健康植株。西洋参感染根腐病后，根际土壤中芽胞杆菌属、鞘氨醇单胞菌属和芽单胞菌属相对丰度减少，而假单胞菌属和鞘脂菌属相对丰度增加，即细菌群落平衡被打破，导致根腐病的发生[13]。由此可见，根际土壤细菌群落在植物与土壤生态系统循环中扮演着重要角色[14]。目前，未见相关多花黄精健康植株与根腐病植株根际土壤细菌群落组成方面的研究报道。为此，本研究通过测定多花黄精健康植株、根腐病病株及未种植多花黄精土壤的酶活性，并采用Illumina Hiseq 2500高通量测序技术对细菌群落结构及多样性进行分析，明确多花黄精根际土壤中的有益细菌菌群，为研究多花黄精根腐病的发生原因、筛选生防细菌提供理论基础，以期深入了解多花黄精根腐病的发生机制，为其综合防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 根际土壤样品采集

根际土壤样品采集于重庆市南川区三泉镇（29°8'14.79″N，107°13'23.25″E），海 拔890 m，年降水量为1 180 mm，土壤类型为砂质壤土。据调查，多花黄精根腐病发病率在11%～23%，发病初期，植株的地上茎干、叶片无明显症状，根茎呈水渍状褐色坏死斑点，土壤湿度大时，根茎表面可见白色霉层，病株极易从土壤中拔出，严重时根茎病部呈褐色或红褐色，地上茎干、叶片枯黄，最后植株枯死。于2019年7月多花黄精根腐病发病盛期，按照五点取样法，各选取5株健康植株和根腐病发病严重的植株，挖出根茎，抖去地表杂草和附着在根状茎的土壤，用毛刷刷下须根上的土壤，将土壤样品分别编号为HJJ和HJB。按上述方法采集土层深度为5～15 cm未种植过多花黄精的土壤，样品编号为HJCK。将所有土壤样品置入无菌自封袋中，带回实验室，一部分土壤样品过筛保存在DW-HL398S型冰箱（中科美菱低温科技股份有限公司）用于土壤基因组DNA提取和测序，一部分置于阴凉通风处干燥，过筛（80目）后用于土壤酶活性的测定。

1.2 土壤酶活性的测定

参照关松荫[15]的方法测定多花黄精根际土壤样品中的5种酶活性，即采用高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶、3, 5-二硝基水杨酸比色法测定蔗糖酶、靛酚蓝比色法测定脲酶、福林酚比色法测定酸性蛋白酶和磷酸苯二钠比色法测定酸性磷酸酶。

1.3 土壤基因组DNA的提取

分别称取三组土壤样品 0.5 g，使用 DP336 土壤基因组 DNA 提取试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］，按照试剂盒说明书逐步进行，提取DNA后利用TU-1810型紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）测定DNA样品浓度，并利用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品纯度，稀释保存备用。

1.4 文库构建及高通量测序

以稀释后的三组土壤样品基因组DNA为模板，使用细菌16S rRNA基因序列的通用引物对338F806R并结合Illumina Hiseq 2500测序平台的V3～V4高变区片段进行PCR扩增。PCR反应体系：模板DNA 2 μL，上下游引物（浓度为10 μmol/L）各1 μL，Taq Master Mix（2×）10 μL，dd H2O 6μL，共20 μL。反应程序为 95 ℃预变性 5 min，94℃ 变性1 min，53℃退火 1 min，72℃延伸1.5 min，共30个循环。PCR扩增产物使用2.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测后，用试剂盒（AXYGEN公司）对目标片段进行回收。将回收产物送至北京百迈克生物科技有限公司进行高通量测序，最终数据分析均在北京百迈克生物科技有限公司BMKCloud云平台网站（http://console.biocloud.net/）完成。

2 结果与分析

2.1 土壤酶活性变化

未种植土壤中过氧化氢酶活性明显高于种植过多花黄精的土壤，即HJCK与HJJ、HJB的氧化氢酶活性差异明显（P＜0.05），HJJ和HJB两者间的氧化氢酶活性差异无统计学意义（P＞0.05）。HJB中蔗糖酶活性明显低于HJJ和HJCK （P＜0.05），而HJJ和HJCK两者间差异无统计学意义（P＞0.05）。脲酶和酸性蛋白酶的活性以HJCK最高，HJJ次之，HJB最低，且三者之间有明显的差异（P＜0.05）。三组土壤中酸性磷酸酶活性从高到低分别为HJCK、HJJ和HJB，但它们之间差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 未种植多花黄精土壤与多花黄精健株、病株根际土壤酶活性的差异（±s， n = 3）Tab. 1 The enzyme activities change of P. cyrtonema soil in healthy，root-rot plants and never planted soil（±s， n = 3）

表1 未种植多花黄精土壤与多花黄精健株、病株根际土壤酶活性的差异（±s， n = 3）Tab. 1 The enzyme activities change of P. cyrtonema soil in healthy，root-rot plants and never planted soil（±s， n = 3）

注: 同列字母完全不同，表示差异具有统计学意义（P＜0.05），下表同。

样品名称 过氧化氢酶/[μmol/（h·g）] 蔗糖酶/[mg/（d·g）] 脲酶/[μg/（d·g）] 酸性蛋白酶/[μg/（h·g）]酸性磷酸酶/[nmol/（h·g）]HJB 413.35±3.81b 41.80±0.66b 436.79±5.43c 35.42±0.94c 1 409.14±18.94a HJJ 420.30±5.15b 44.65±0.76a 449.91±4.55b 51.53±1.76b 1 416.29±35.57a HJCK 462.11±7.41a 45.02±0.41a 505.57±4.86a 60.41±2.44a 1 432.23±28.86a

2.2 测序数据和OUT聚类分析

经测序分析最终用于后续分析的有效序列共285 903条，其中HJJ土样有 68 539条，有效率为85.59%；HJB土样有 85 556条，有效率为90.11%；HJCK土样131 808条，有效率为89.98%。HJB、HJJ、HJCK有效序列长度分别为420 bp、421 bp和421 bp，见表2。

表2 三组土壤样品细菌基因组总 DNA 高通量测序所得序列数据特征Tab. 2 Sequence data characteristics of total DNA on soil microbial genome in P. cyrtonema three samples by high throughput sequencing testing

稀释曲线可直接反映优化序列是否合理，并间接反映样品的物种丰富度[16]，由图1可知，当测序数量达到20 000时，随着测序数量的增加，稀释曲线趋于平缓，表明三组土壤样品所测的序列阵容都能够较好的反映细菌群落种类数量，测序数据基本合理。基于97%的序列相似性阈值可获得1 753个OTUs，其中HJB均值为1 675个OTUs，HJJ均值为1 638个OTUs，HJCK均值为1 715个OTUs。Venn图结果表明，HJCK、HJJ、HJB三组共有OTUs 1 545个，其中HJCK特有OUTs为7个， HJJ为3个， HJB为13个。同时，HJCK与HJJ共有OTUs 68个，HJJ与HJB共有OTUs为99个，而HJCK与HJB共有OTUs仅为18个。由此可推断出，未种植过多花黄精的土壤与种植过多花黄精的土壤（无论患病与否）微生物群落差距较大；而多花黄精健株土壤与病株土壤之间虽有差异，但其土壤根际微生物含有共同种群相对较多。

图1 多花黄精根际细菌群落的稀释曲线和Venn图Fig. 1 Rarefaction curves and Venn diagram of microbial commumities in soils samples of P. cyrtonema OUTs abundance

2.3 土壤细菌α-多样性分析

三组土壤细菌群落α-多样性分析表明物种覆盖度均达到99%，表明样品数据真实可靠。从ACE指数及Chaol指数来看，三组土壤样品中物种丰富度由高到低为HJCK＞HJB＞HJJ，且Chaol指数具有显著性差异，由此可见种植多花黄精后土壤物种丰富度下降，数量减少。HJB、HJJ、HJCK土壤样品的Simpson和Shannon指数表明三组样品中土壤细菌的多样性差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 土壤细菌 α-多样性分析（±s， n = 3）Tab. 3 Alpha analysis of fungi strains in soil（±s， n = 3）

表3 土壤细菌 α-多样性分析（±s， n = 3）Tab. 3 Alpha analysis of fungi strains in soil（±s， n = 3）

样品名称 ACE Chaol Simpson Shannon 覆盖度/%HJB 1 696.14±109.86ab 1 704.45±104.86b 0.992 5±0.00a 6.63±0.00a 0.996±0.00a HJJ 1 657.80±162.84b 1 671.00±121.83c 0.992 4±0.00a 6.65±0.00a 0.992±0.00a HJCK 1 724.58±130.05a 1 745.52±117.37a 0.992 5±0.00a 6.64±0.00a 0.991±0.00a

2.4 根际土壤细菌群落组成

三组土壤样品中细菌归属于27个门。HJCK和HJB、HJJ土样细菌在门水平上的丰度差异比较大，前10种优势细菌门，见图2。三组土壤样品细菌中，相对丰度大于1%的细菌组成由高到低进行排列，依次是变形菌门（Proteobacteria，34.01% ～ 36.55%）、酸杆菌门（Acidobacteria，16.41% ～ 26.16%）、绿弯菌门（Chloroflexi，5.89%～12.88%）、拟杆菌门 （Bacteroidetes，4.76%～8.39%）、放线菌门（Actinobacteria，5.39%～6.74%）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes，4.89%～6.09%）、疣微菌门（Verrucomicrobia，3.06%～4.47%）、浮霉菌门（Planctomycetes，2.14%～3.89%）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae，1.76%～2.18%）、迟发型细菌门（Latescibacteria，1.10%～2.23%）；其中，三组土壤样品中变形菌门相对丰度的比例最高，明显高于其它门类；HJB土样中的酸杆菌门和绿弯菌门相对丰富高于HJCK、HJJ土样，而HJCK、HJJ土样中放线菌门的相对丰度高于HJB土样，表明多花黄精感染根腐病后导致根际土壤细菌群落结构的改变，造成其生长环境的恶化。

在属水平上，未鉴定出的细菌相对丰度为64.18% ～71.23%。相对丰度排名前十细菌而言，uncultured_bacterium_c_Subgroup_6（7.74% ～ 14.83%）、uncultured_bacterium_f_Gemmatimonadaceae（3.22% ～4.33%）、uncultured_bacterium_f_Micro-scillaceae（1.02% ～ 4.24%）、MND1（1.04% ～ 2.96%）、硝化螺旋菌属Nitrospira（1.91% ～ 2.18%）、鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas（1.54% ～ 2.28%）、uncultured_bacterium_f_SC-I-84（1.09% ～ 2.17%）、uncultured_bacterium_f_Pedosphaeraceae（1.06% ～ 2.56%）、黄杆菌属Flavobacterium（0.99% ～ 2.52%）、RB41（1.27% ～ 2.20%）。

为了更直观的展现未种植多花黄精土壤和健株、病株多花黄精根际土壤细菌种群的相似性及变异，在门水平上，使用R软件，对三组土壤样品中排名前27门绘制聚类热图，见图3。横向细菌群落根据进化关系聚类为两大分支，其中HJCK独自为一类，而HJJ与HJB归为一类。纵向OUT可以分为三大类，菌群Ⅰ在HJB组丰度最高，菌群Ⅱ在HJCK组丰度最高，菌群Ⅲ在HJJ组丰度最高。

从图3可以看出，HJB土壤样品中异常球菌-栖 热 菌 门（Deinococcus-Thermus）、己 科 河 菌 门（Rokubacteria）、GAL15、绿弯菌门（Chloroflexi）、厚壁菌门（Firmicutes）、食氢菌门（Hydrogenedentes）相对丰度较高，Omnitrophicaeota、疣微菌门（Verrucomicrobia）、FCPU426相对丰度较低；HJJ土壤样品中Dependentiae、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、装甲菌门（Armatimonadetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、FCPU426相对丰度较高，绿弯菌门（Chloroflexi）、螺旋体门（Spirochaetes）相对丰度较低；HJCK土壤样品中变形菌门（Proteobacteria）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、匿杆菌门（Latescibacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）、蓝藻门（Cyanobacteria）、迷踪菌门（Elusimicrobia）、纤维杆菌门（Fibrobacteres)、放线菌门（Actinobacteria)、Patescibacteria、肠杆菌门（Entotheonellaeota)相对丰度较高，Armatimonadetes、Acidobacteria、WS2相对丰度较低。

图 2 门和属水平上的物种相对丰度Fig. 2 Relative abundance of species at phylum and genus level

图3 基于样品丰度前27的细菌物种丰度聚类热图Fig. 3 Clustering heat map of bacterial species abundance based on the 27 samples before abundance

3 讨论

土壤酶主要来源于土壤中动、植物和微生物的分泌物及残体腐烂分解物[15,17]，它参与土壤中的生物化学反应，对土壤肥力起着重要作用，因此作为土壤生态系统变化的指标之一[18]。通过测定土壤酶活性结果表明，与HJCK相比，种植多花黄精后土壤中的酶活性发生了明显变化。多花黄精感染根腐病后，HJB中过氧化氢酶、蔗糖酶、脲酶、酸性蛋白酶、酸性磷酸酶活性均低于HJJ。而宋旭红等[19]研究表明，与黄连健康植株相比，根腐病土壤中过氧化氢酶和脲酶活性显著降低。杨绍琼等[20]发现香蕉感染枯萎病后，河口县4个地区感病植株根系附近土壤蔗糖酶活性高于健康植株。三七[21]、黄芪[22]、烟草[23]和青稞[24]根腐病的发生均与土壤酶活性的变化密切相关。实验发现多花黄精根腐病发生后，根际土壤中过氧化氢酶、蔗糖酶等5种酶活性降低，表明多花黄精根腐病的发生与土壤酶活性有一定的关系。

多花黄精根腐病主要由尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、腐 皮 镰 刀 菌F.Solani、F.Foetens和F.Hostae等镰刀菌属病原菌引起[25-26]。当土壤中病原微生物大量滋生繁殖，而有益微生物减少时，就会引起植物病害的发生[27]，因此土壤微生物群落结构变化是影响植物土传病害发生的重要因素。通过扩增HJJ、HJB和HJCK根际土壤细菌V3 ～ V4区域，采用高通量测序技术探究栽培多花黄精后土壤细菌群落的变化和多样性进行分析，分别获得68 539、85 556、131 808条有效序列，平均长度为420 bp，说明高通量测序方法分析多花黄精根腐病和健康根际土壤细菌群落组成和多样性具有可行性。由土壤多样性分析可知，ACE指数和Chaol指数为HJCK＞HJB＞HJJ，同时Shannon指数和Simpson指数差异无统计学意义，由此可得三种土壤中物种多样性差异不大，但细菌数量具有显著性差异，且未种植过黄精的土壤中细菌相对丰度较大。高通量测序结果表明，多花黄精三组土壤样品中共鉴定细菌27门，其中，变形菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、放线菌门在所有土壤样品中相对丰度高，是主要优势菌门。黄穗萍等[28]研究发现，广西香蕉根际及非根际土壤细菌中最丰富的门类为变形菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、放线菌门等。李茂森等[29]报道了遵义3 个海拔下植烟土壤优势门为放线菌门、变形菌门、绿弯菌门和酸杆菌门。百香果[30]、马铃薯[31]、茶树[32]等其它植物根际土壤的研究显示相似的优势菌。而HJB中细菌相对丰度大于HJJ，可能是因为植株病变后，植物内生菌引起外界根际土壤细菌群落增加，从而细菌数量增加。从土壤细菌门的丰度来看，三组土壤中含量差异较大的是酸杆菌门和拟杆菌门。多花黄精感染根腐病后土壤逐渐酸化[33]，导致酸性细菌增多，酸杆菌门是一类适宜在弱酸条件下生长的细菌。HJCK、HJJ中酸杆菌门相对丰度低于HJB，由此可见酸杆菌门是影响多花黄精根部病变的主要细菌之一。拟杆菌门在HJJ根际土壤中相对丰度高于HJB，这可能是拟杆菌门能促进健康植株碳源的吸收利用[34-35]，从而提高了多花黄精的抗病性。

4 结论

多花黄精HJB土壤中的土壤酶活性均比HJJ和HJCK低，其土壤中物质转化能力比HJJ和HJCK低；16S rRNA 高通量测序三组土壤细菌多样性和群落结构，结果表明，HJB、HJJ和HJCK分别得到的OUTS 数分别为 1 675、1 638、1 715；变形菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、放线菌门、芽单胞菌门是三组土壤中的主要优势菌门。因此，多花黄精病株根际土壤酶活性和细菌群落结构的变化或许是导致多花黄精根腐病发生的重要原因。