组蛋白去乙酰化酶9基因rs73307079位点与烟雾病发生风险的关系

彭俊宇，邢红霞，吴亦琦，刘梦豪，左书茜，张雪薇，邢瑶平，李超堃，赵新利

(1.新乡医学院第一附属医院神经内科，河南 卫辉 453100;2.新乡市运动障碍性疾病重点实验室，河南 新乡 453003;3.新乡医学院第三附属医院神经内科，河南 新乡 453003;4.新乡医学院基础医学院生理学与病理生理学教研室，河南 新乡 453003;5.河南省生物精神病学重点实验室，河南 新乡 453002；6.新乡医学院第一附属医院神经外科，河南 卫辉 453100)

烟雾病(moyamoya disease,MMD)是一种血管造影表现为颅内特定部位动脉狭窄或闭塞，并伴有烟雾样血管增生的脑血管疾病[1-2]。MMD常表现为脑梗死、短暂性脑缺血发作、蛛网膜下腔出血、脑实质出血、认知障碍、头痛、癫痫发作等，是儿童和青年卒中的原因之一[3-4]。目前，MMD的病因尚未阐明，有研究表明，遗传因素在其发生及进展中占据重要地位[5-6]。多项研究表明，组蛋白去乙酰化酶9(histone deacetylase 9,HDAC9)基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与颅内大血管病变所致卒中相关[7-12]。MMD为一种颅内大血管病变且主要表现为卒中，因此，推测HDAC9基因SNP位点与MMD可能存在一定关联。DUAN等[13]的一项全基因组关联研究表明，HDAC9基因rs73307079位点与中国汉族人群MMD的发生存在关联。基于此，本研究通过探讨MMD患者HDAC9基因rs73307079位点与MMD发生风险的关系及该位点不同基因型对HDAC9基因表达的影响，以期定位MMD的易感基因及其生物学功能。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2019年9月至2020年12月于新乡医学院第一附属医院神经内科及神经外科就诊的54例MMD患者为MMD组，患者均符合MMD诊断标准[14]，排除由动脉粥样硬化、自身免疫性疾病、颅内感染、颅内肿瘤、唐氏综合征、神经纤维瘤病、头部接触放射性及脑外伤因素所致的颅内烟雾样脑血管病变者。另选择53名性别、年龄与MMD组匹配的健康体检者作为对照组。MMD组：男26例，女28例；年龄20～71(51.70±11.08)岁。对照组：男25例，女28例；年龄26～74(52.19±10.22)岁。2组受试者的性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经过医院医学伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书，并签署知情同意书。

1.2 HDAC9基因rs73307079位点SNP检测

1.2.1 血液基因组DNA提取采集所有研究对象空腹外周静脉血6 mL于乙二胺四乙酸试管中。使用血液基因组提取试剂盒(北京天根生化科技公司)提取基因组DNA，严格按照试剂盒说明书进行操作。使用WD9409B紫外分析仪检测DNA的浓度及纯度,置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 HDAC9基因rs73307079位点引物设计与合成通过NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)SNP数据库查询HDAC9基因rs73307079位点所在位置及附近DNA序列，应用Oligo Analyzer软件设计扩增引物，并通过NCBI网站Nucleotide BLAST程序检验引物特异性。rs73307079位点上游引物序列为5′-CTCTTCATTTATCTTTCCTCC-3′，下游引物序列为5′-GCCAGGTATTGTTTTAAGTTC-3′。rs73307079位点引物由郑州久是生物技术有限责任公司合成。

1.2.3 HDAC9基因rs73307079位点DNA片段获取采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)法扩增HDAC9基因rs73307079位点DNA片段。PCR反应体系：基因组DNA 1 μL，上、下游引物各1.5 μL，2×Taq Master Mix 25 μL，双蒸水21 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃终末延伸10 min。

1.2.4 PCR产物测序及基因分型将PCR产物行琼脂糖凝胶电泳后，应用紫外凝胶成像仪成像，选取单一条带的PCR产物，将其送苏州金唯智生物科技有限公司行DNA Sanger测序，将所测序列比对正常序列，应用Chromas软件读取测序峰图以得出所有受试者的HDAC9基因 rs73307079位点基因型。

1.3 实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)法检测HDAC9基因 mRNA相对表达量从MMD组中分别随机选择HDAC9基因 rs73307079位点 TT、TC、CC基因型患者各5例。使用TRIzol试剂从患者血液样本中提取总RNA，使用反转录试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司)将RNA反转录为cDNA，并进行qRT-PCR。反应体系：2×SYBR Green qPCR Master Mix 7.5 μL，上、下游引物各1.5 μL，cDNA模板2.0 μL，灭菌双蒸水4.0 μL。反应程序：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸30 s，共40个循环。HDAC9基因上游引物序列为5′-CCTTCTTTGCCCAACATTACCT-3′，下游引物序列为5′-CACCTTGCCTAAGCGTCTGC-3′；内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶上游引物序列为5′-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3′，下游引物序列为5′-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3′。每个样本设置3个重复反应孔，采用2-△△Ct法计算HDAC9基因mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 2组受试者HDAC9基因rs73307079位点基因型和等位基因分布比较结果见表1。对照组受试者的基因型分布符合HWE(P>0.05)，样本具有代表性。MMD组和对照组受试者rs73307079位点均存在TT、TC、CC 3种基因型及T、C 2种等位基因。MMD组受试者TT基因型频率显著低于对照组，TC基因型频率显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。2组受试者的CC基因型频率比较差异无统计学意义(P>0.05)。2组受试者的T、C 2种等位基因分布比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 2组受试者HDAC9基因rs73307079位点基因型和等位基因分布比较

2.2 不同遗传模式下rs73307079位点基因型与MMD发生风险的关联性分析结果见表2。以rs73307079位点多态性为自变量，以是否患有MMD为因变量，经校正年龄、性别后，在不同遗传模式下进行二元logistic分析，结果显示，在加性遗传模型下，TC基因型携带者发生MMD的风险显著高于TT基因型携带者，差异有统计学意义(P<0.05)；CC基因型携带者与TT基因型携带者的MMD发生风险比较差异无统计学意义(P>0.05)。在显性遗传模型下，TC+CC基因型携带者发生MMD的风险显著高于TT基因型携带者，差异有统计学意义(P<0.05)。在隐性遗传模型下，CC基因型携带者与TT+TC基因型携带者的MMD发生风险比较差异无统计学意义(P>0.05)。在超显性遗传模型下，TC基因型携带者发生MMD的风险显著高于TT+CC基因型携带者，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 不同遗传模式下rs73307079位点基因型与MMD发生风险的关联性分析

2.3 rs73307079位点不同基因型MMD患者HDAC9 mRNA相对表达量比较MMD组患者中rs73307079位点TT、TC、CC基因型患者的HDAC9 mRNA相对表达量分别为1.173±0.642、1.123±0.203、1.045±0.386，两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

研究发现，环指蛋白213基因突变能够显著增加日本和韩国人群患MMD的风险，但在中国人群中的致病作用较低，且在中国其高突变率地区与MMD高发病地区并不一致，中国MMD患者存在更复杂的致病因素，除环指蛋白213基因外，基质金属蛋白酶3基因等也被报道与MMD发生存在关联[4,15-16]。目前，关于我国人群MMD的病因及机制尚未阐明。

MMD作为一种大血管病变，脑卒中是该病常见的发病形式，其可能与既往已报道的相关基因存在关联[7-10]，这有望为解读MMD的致病机制及定位新的易感基因提供新的方向。由病例对照研究协会和国际卒中遗传学协会在欧洲人群中进行的一项全基因组关联研究表明，HDAC9基因rs11984041位点与大血管病变所致卒中的发生存在关联[7]。TRAYLOR等[11]的荟萃分析发现，HDAC9基因rs2107595位点能够明显增加大血管病变所致卒中患病风险。HAN等[12]通过病例对照研究表明，HDAC9基因rs2389995位点与发生大血管病变所致卒中显著相关。HDAC9基因作为大血管病变所致卒中最密切的风险位点已被多项研究报道，该基因编码的HDAC9可以通过组蛋白去乙酰化作用，改变与疾病发生相关的启动子区域染色质结构或降低相应转录因子的转录活性来调节基因表达，从而抑制转录过程[17]。HDAC9在氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、血管生成等多种生物过程中发挥重要作用[18-19]。

DUAN等[13]进行的一项全基因组关联研究表明，MMD组患者HDAC9基因rs73307079位点T等位基因频率显著低于对照组。本研究结果显示，2组受试者的T、C 2种等位基因分布比较差异无统计学意义，这可能与本研究的样本量较小有关，有限的样本量不足以显示这一实际存在的差异。

本研究结果发现，MMD组受试者TT基因型频率显著低于对照组，TC基因型频率显著高于对照组；此外，在加性遗传模型下，TC基因型携带者发生MMD的风险显著高于TT基因型携带者，提示HDAC9基因rs73307079位点TC基因型携带者发生MMD的风险较高，TT基因型携带者发生MMD的风险较低。本研究结果中，在加性遗传模型下CC基因型携带者与TT基因型携带者的MMD发生风险比较差异无统计学意义，但在显性遗传模型下TC+CC基因型携带者发生MMD的风险显著高于TT基因型携带者，这可能与TC基因型携带者对MMD高易感性有关，同时也说明HDAC9基因rs73307079位点CC基因型和TT基因型携带者发生MMD的风险相当且均不高。HDAC9基因rs73307079位点不同基因型携带者发生MMD的风险可能存在差异，原因可能为：不同的基因型会产生不同的生物学效应，通过直接影响其所在基因或间接影响其他基因的表达发挥作用。HDAC9基因rs73307079位点TC基因型可作为MMD高风险人群标志物，以协助临床工作者对该人群尽早进行干预。

基因的3′非编码区域的SNP位点可调控相应蛋白的翻译过程，从而影响基因的表达水平[20-21]。rs73307079位于HDAC9基因3′端内含子序列中，该位点的生物学功能未见有文献进行相关报道。有研究发现，HDAC9基因中另一与大血管病变所致卒中相关的SNP位点rs2107595位于该位点附近，其不同基因型携带者外周血中HDAC9 mRNA的表达水平不同，rs2107595位点的不同基因型可能通过影响HDAC9的表达来介导大血管病变所致卒中的发生[22]。本研究通过qRT-PCR检测rs73307079位点不同基因型携带者外周血HDAC9 mRNA的表达水平，结果显示，该位点不同基因型对HDAC9 mRNA表达无明显差异，这说明rs73307079位点不同基因型携带者增加MMD发病的风险不是通过影响HDAC9的表达来实现的，该位点的功能需要进一步探究。

综上所述，HDAC9基因rs73307079位点基因型多态性与MMD的发生存在关联，但不影响HDAC9基因表达水平，该位点的TC基因型携带者具有较高的MMD发病风险。