表没食子儿茶素没食子酸酯乙基化衍生物Y6对耐阿霉素人肝癌细胞丝裂原活化蛋白激酶通路的影响

黄 川，吴美怡，谢战洪，赵瑞强，温 燕

(1.广西医科大学药学院，广西 南宁 530021；2.广西高校生物分子医学研究重点实验室，广西 南宁 530021；3.广西医科大学第一附属医院药学部，广西 南宁 530021)

肝癌是一种恶性程度高、复发率高的恶性肿瘤，化学治疗是治疗肝癌必不可少的手段之一，但在治疗过程出现的肿瘤多药耐药现象使得化学治疗药物的应用严重受阻[1]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一组广泛存在于哺乳动物细胞内且可被多种信号激活的丝/苏氨酸蛋白激酶。研究认为，MAPK信号转导通路参与肿瘤的化学治疗耐药过程，其作用机制可能是调控耐药相关基因的表达[2]。MAPK有多个亚家族，目前已确定在细胞功能上发挥重要作用的有细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2,ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38)。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是一种茶叶中活性最高的儿茶素。研究证明，EGCG不仅可以在体外逆转耐阿霉素(doxorubicin,DOX)人肝癌细胞BEL-7404/DOX的耐药性，而且还可以与抗肿瘤药物联合抑制BEL-7404/DOX细胞移植瘤裸鼠体内肿瘤的生长[3]。但由于EGCG的分子侧链含有大量酚羟基，易氧化变性，导致其性质不够稳定，脂溶性差，生物利用度低，体内代谢快，维持时间短，药理活性不高，从而限制了其应用。本课题组前期对EGCG进行结构改造，筛选出了毒性低、稳定性高、脂溶性好的乙基化衍生物Y6。研究发现,及15 μmol·L-1Y6分别联合10 μmol·L-1DOX对耐DOX人肝癌细胞BEL-7404/DOX具有不同程度的逆转作用，并且对细胞无明显毒性[4]。在此基础上，本研究进一步以耐DOX人肝癌细胞BEL-7404/DOX为研究对象，观察Y6干预后其MAPK信号通路相关蛋白的表达，旨在探讨Y6对耐DOX人肝癌细胞BEL-7404/DOX的MAPK信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株耐DOX人肝癌细胞BEL-7404/DOX由广西医科大学基础医学院病理生理学教研室提供。

1.2 主要试剂与仪器DOX购自深圳万乐药业有限公司(国药准字 H44024360)，维拉帕米(verapamil,VER)购自上海禾丰制药有限公司(国药准字 H31021343)，EGCG购自杭州禾田生物技术有限公司，Y6由本课题组前期自主合成，IgG抗体、β-actin抗体、ERK1/2抗体、p38抗体、JNK抗体、磷酸化ERK1/2(phosphorylated ERK1/2,p-ERK1/2)抗体、磷酸化p38(phosphorylated p38,p-p38)抗体、磷酸化JNK(phosphorylated JNK,p-JNK)抗体购自美国CST公司，达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)购自美国HyClone公司,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，增强型化学发光(enhanced chemiluminescence,ECL)试剂盒购自美国Thermo公司，放射免疫沉淀(radioi-mmunoprecipitation,RIPA)裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司，苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)蛋白酶抑制剂购自北京恒鑫生物科技有限公司，聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜购自美国Sigma公司；CO2细胞培养箱购自美国Thermo公司，MULTISKAN MK3酶标仪购自美国Thermo公司,BS97MyCycler转膜仪购自美国Bio-Rad公司，DMR倒置显微镜照相系统购自日本Olympus公司。

1.3 细胞培养将BEL-7404/DOX细胞置于含体积分数10%胎牛血清、1.0×105U·L-1青霉素、100 mg·L-1链霉素的DMEM中,于37 ℃、含体积分数5%CO2的恒温培养箱中传代培养，期间培养液中加入终质量浓度为2 mg·L-1的DOX以维持BEL-7404/DOX细胞的耐药性。细胞用于正式实验前7 d给予不含DOX的培养液培养，之后取对数生长期细胞用于后续实验。

1.4 细胞分组及药物处理取对数生长期的BEL-7404/DOX细胞用胰酶进行消化，均分至6个25T透气培养瓶中培养，随机分为空白对照组、DOX组、DOX+VER组、DOX+EGCG组、DOX+低剂量Y6组和DOX+高剂量Y6组，待细胞融合至80%左右，吸弃旧培养液，各实验组加入相应药物进行处理：空白对照组不加入任何药物；DOX组加入终浓度为10 μmol·L-1的DOX；DOX+VER组加入终浓度为10 μmol·L-1的DOX和10 μmol·L-1的VER；DOX+EGCG组加入终浓度为10 μmol·L-1的DOX和10 μmol·L-1的EGCG；DOX+低剂量Y6组加入终浓度为10 μmol·L-1的DOX和10 μmol·L-1的Y6；DOX+高剂量Y6组加入终浓度为10 μmol·L-1的DOX和15 μmol·L-1的Y6；各组细胞加药完毕后，置于37 ℃、含体积分数5% CO2恒温培养箱中培养48 h。

1.5 Western blot法检测各组细胞中p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK、JNK、p-p38及p38蛋白表达取“1.4”项干预 48 h 后的各组细胞，各加入300 μL RIPA裂解液、3 μL PMSF及6 μL磷酸酶抑制剂混合物A，4 ℃放置15～30 min，收集细胞裂解混合液，4 ℃ 12 000×g离心10 min，取上清液。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度。在制作的电泳胶板加样孔中加入含 25 μg蛋白样品，恒流 60 mA进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳1 h，将分离胶的蛋白电转移至PVDF膜(150 mA，1.5 h)，用50 g·L-1脱脂牛奶常温摇床封闭1 h，用含体积分数0.05%吐温-20的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液(Tris-buffered saline with 0.05% tween-20,TBST)洗膜后剪下目的蛋白膜和内参蛋白膜，加入p-ERK1/2(11 000)、p-p38(11 000)、p-JNK(11 000)、ERK1/2(11 000)、p38(11 000)、JNK(11 000)和β-actin(1500)一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后加入IgG(11 000)二抗，常温摇床孵育2 h，TBST洗膜。ECL法显影后进行胶片扫描，用Image J 软件量化条带的灰度值，以目的条带灰度值与内参条带灰度值的比值代表蛋白相对表达量，并计算p-ERK1/2与ERK1/2蛋白相对表达量的比值(p-ERK1/2/ERK1/2)、p-JNK与JNK蛋白相对表达量的比值(p-JNK/JNK)、p-p38与p38蛋白相对表达量的比值(p-p38/p38)。

2 结果

2.1 6组耐DOX人肝癌细胞BEL-7404/DOX中p-ERK1/2/ERK1/2比较结果见表1和图1。DOX组耐DOX人肝癌细胞中p-ERK1/2/ERK1/2与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。DOX+VER组、DOX+EGCG组、DOX+低剂量Y6组和DOX+高剂量Y6组耐DOX人肝癌细胞中p-ERK1/2/ERK1/2均显著高于空白对照组和DOX组，差异均有统计学意义(P<0.05)。DOX+VER组、DOX+EGCG组、DOX+低剂量Y6组和DOX+高剂量Y6组耐DOX人肝癌细胞中p-ERK1/2/ERK1/2比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1 6组耐DOX人肝癌细胞BEL-7404/DOX中p-ERK1/2/ERK1/2比较

1：空白对照组；2：DOX组；3：DOX+VER组；4：DOX+EGCG组；5：DOX+低剂量Y6组；6：DOX+高剂量Y6组。

2.2 6组耐DOX人肝癌细胞BEL-7404/DOX中p-JNK/JNK比较结果见表2和图2。与空白对照组比较，DOX组、DOX+VER组、DOX+EGCG组、DOX+低剂量Y6组和DOX+高剂量Y6组耐DOX人肝癌细胞中 p-JNK/JNK均显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)。与DOX组比较，DOX+VER组、DOX+高剂量Y6组耐DOX人肝癌细胞中p-JNK/JNK均显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)；DOX+EGCG组、DOX+低剂量Y6组耐DOX人肝癌细胞中p-JNK/JNK与DOX组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与DOX+VER组比较，DOX+EGCG组、DOX+低剂量Y6组耐DOX人肝癌细胞中p-JNK/JNK均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与DOX+低剂量Y6组比较，DOX+高剂量Y6组耐DOX人肝癌细胞中p-JNK/JNK显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 6组耐DOX人肝癌细胞BEL-7404/DOX中p-JNK/JNK比较

1：空白对照组；2：DOX组；3：DOX+VER组；4：DOX+EGCG组；5：DOX+低剂量Y6组；6：DOX+高剂量Y6组。

2.3 6组耐DOX人肝癌细胞BEL-7404/DOX中p-p38/p38比较结果见表3和图3。与空白对照组比较，DOX组、DOX+VER组、DOX+EGCG组、DOX+低剂量Y6组和DOX+高剂量Y6组耐DOX人肝癌细胞中p-p38/p38均显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)。与DOX组比较，DOX+VER组、DOX+EGCG组、DOX+低剂量Y6组和DOX+高剂量Y6组耐DOX人肝癌细胞中p-p38/p38均显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)。与DOX+VER组比较，DOX+EGCG组、DOX+低剂量Y6组耐DOX人肝癌细胞中p-p38/p38均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。DOX+EGCG组、DOX+低剂量Y6组、DOX+高剂量Y6组耐DOX人肝癌细胞中的p-p38/p38比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表3 6组耐DOX人肝癌细胞BEL-7404/DOX中p-p38/p38比较

1：空白对照组；2：DOX组；3：DOX+VER组；4：DOX+EGCG组；5：DOX+低剂量Y6组；6：DOX+高剂量Y6组。

3 讨论

原发性肝癌是一种起源于肝细胞或肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤，其中肝细胞癌约占所有原发性肝癌的90%。目前，大部分肝癌患者确诊时已为晚期，不适合手术切除肿瘤，化学治疗是主要的治疗方法。然而，肝癌细胞获得耐药性仍是肝癌化学治疗的临床障碍，癌细胞获得性耐药是一个多因素的过程，其所涉及的各种细胞生理活动都与细胞内复杂的多向信号转导系统以及各种激酶的激活关系密切[5-6]。因此，寻找能够逆转肝癌细胞耐药的药物且深入了解逆转剂对耐药细胞内相关信号转导系统及激酶的影响，对于克服化学治疗耐药尤为重要。Y6是EGCG乙基化衍生物，研究表明，Y6能够有效逆转多药耐药性，是一种潜在的逆转剂[7-8]。

MAPK信号转导通路是将细胞外刺激信号转导至细胞核内的重要信号转导系统，主要包括ERK1/2、JNK和p38通路。MAPK信号通路不仅调节细胞的增殖、分化、凋亡和细胞间的相互作用,且在肿瘤的发生以及逆转肿瘤多药耐药机制中发挥了重要作用[9-11]。HSIEH等[12]在鼻咽癌多耐药性研究中发现，用雷公藤红素诱导耐顺铂鼻咽癌细胞凋亡时，细胞内p38、ERK1/2和JNK1/2磷酸化水平增加，提示雷公藤红素可能通过激活MAPK通路诱导耐药细胞周期阻滞和凋亡；应用p38抑制剂SB203580和ERK1/2抑制剂U0126后caspase-3和caspase-8的激活显著减弱，进一步证实鼻咽癌耐药细胞凋亡是与MAPK信号通路的激活有关。CHAI等[13]研究发现，在耐DOX人乳腺癌细胞中p38和ERK信号通路被显著激活，同时P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)表达量显著高于亲本细胞株；进一步研究发现，长柱重楼总皂苷能够通过抑制耐DOX人乳腺癌细胞中ERK通路下调P-gp的表达，从而增加DOX的细胞毒性。以上研究证实，MAPK信号通路参与逆转肿瘤的多药耐药性。

为探讨Y6在逆转耐DOX人肝癌细胞BEL-7404/DOX耐药过程中对MAPK信号通路的影响，本研究采用Western blot法检测各组细胞中MAPK信号通路相关蛋白的表达,并评估ERK1/2、JNK、p38蛋白的磷酸化程度及活性的变化，结果显示，单用DOX处理的耐DOX人肝癌细胞BEL-7404/DOX中p-ERK1/2/ERK1/2与空白对照组比较差异无统计学意义，而DOX+VER组、DOX+EGCG组、DOX+低剂量Y6组和DOX+高剂量Y6组耐DOX人肝癌细胞中p-ERK1/2/ERK1/2均显著高于空白对照组和DOX组，DOX+VER组、DOX+EGCG组、DOX+低剂量Y6组和DOX+高剂量Y6组耐DOX人肝癌细胞中p-ERK1/2/ERK1/2各组间比较差异均无统计学意义，提示Y6通过上调ERKl/2蛋白的磷酸化水平激活了ERK1/2通路，激活效果与等剂量EGCG和VER相当。另外，与空白对照组比较，DOX组、DOX+VER组、DOX+EGCG组、DOX+低剂量Y6组和DOX+高剂量Y6组耐DOX人肝癌细胞中p-JNK/JNK均显著增高，DOX+VER组、DOX+高剂量Y6组耐DOX人肝癌细胞中p-JNK/JNK均显著高于DOX组，而DOX+EGCG组、DOX+低剂量Y6组耐DOX人肝癌细胞中p-JNK/JNK与DOX组比较差异无统计学意义，但DOX+EGCG组、DOX+低剂量Y6组耐DOX人肝癌细胞中p-JNK/JNK显著低于DOX+VER组，且DOX+高剂量Y6组耐DOX人肝癌细胞中p-JNK/JNK显著高于DOX+低剂量Y6组，提示Y6可呈浓度依赖性上调JNK蛋白的磷酸化水平,激活JNK通路,激活效果与等剂量EGCG相当。此外，本研究结果显示，DOX组、DOX+VER组、DOX+EGCG组、DOX+低剂量Y6组和DOX+高剂量Y6组耐DOX人肝癌细胞中p-p38/p38均显著高于空白对照组，而DOX+VER组、DOX+EGCG组、DOX+低剂量Y6组和DOX+高剂量Y6组耐DOX人肝癌细胞中p-p38/p38均显著高于DOX组，而且DOX+EGCG组、DOX+低剂量Y6组耐DOX人肝癌细胞中p-p38/p38值均显著低于DOX+VER组，同时，DOX+EGCG组、DOX+低剂量Y6组、DOX+高剂量Y6组耐DOX人肝癌细胞中p-p38/p38比较差异均无统计学意义，提示Y6通过上调p38蛋白的磷酸化水平激活了p38通路，激活效果与等剂量EGCG相当。本研究结果与HSIEH等[12]的研究结果一致，说明化学治疗药物联合逆转剂作用于耐药细胞后ERK1/2、JNK和p38磷酸化水平均增高,MAPK信号通路被激活。

综上所述，Y6通过上调ERKl/2、JNK及p38蛋白的磷酸化水平激活3条平行的MAPK信号通路逆转耐DOX人肝癌细胞BEL-7404/DOX耐药。本课题组前期报道，Y6作为天然耐药逆转剂能够有效增加耐DOX人肝癌细胞BEL-7404/DOX对DOX的敏感性，其逆转机制可能与降低缺氧诱导因子1α和P-gp表达有关[4]。由此进一步推测，Y6增加DOX的细胞毒作用可能与激活MAPK信号通路调控缺氧诱导因子1α和P-gp的表达有关，MAPK与二者之间的相关机制有待于进一步深入研究。