酵母抽提物中Kokumi 肽的研究进展

常金翠，陈沙，冯涛，熊建，李凡，李沛

(1.上海应用技术大学 香料香精化妆品学部，上海 201418；2.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443000)

酵母抽提物(yeast extract，YE)是以食品用酵母为主要原料，在酶的作用下自溶并分离得到的产品。酵母抽提物富含多种氨基酸、多肽、核苷酸、维生素等物质，具有营养、调味及保健功能，与味精、水解蛋白、呈味核苷酸(I+G)并称为我国四大天然调味料[1-3]。酵母抽提物一般应用于食品工业和生命科学领域，在鸡精、酱油、肉制品及食用香精中已经得到了很好的应用[4]。

“Koku”一词源于日本，它是由味道、香气和质地所引起的整体感觉，它由3个要素组成：复杂性、满口感和绵延感[5]。Kokumi是“koku”加“mi”(“mi”在日语中表示滋味)的复合词，它既不是一种像鲜味那样独特的口味，也不是另一种不同的 koku。Koku是通过添加一些本身没有味道的物质改变味觉信息诱导出来的，这种物质被称为“kokumi 物质”，相当于 koku诱导物质。据报道，从奶酪、豆类、牛骨髓提取物、酱油等物质中分离出的各种肽类，如谷胱甘肽、谷缬甘肽和一些 γ-谷氨酰类的二肽和三肽都属于kokumi物质[6-9]。谷胱甘肽与谷缬甘肽是目前公认的浓厚感较强的kokumi肽。食品中的 kokumi 物质大致可以分为肽类和非肽类两大类。本文主要针对酵母抽提物中kokumi肽的研究进行了归纳总结。

1 酵母抽提物及kokumi 肽概述

中华人民共和国国家标准GB/T 23530-2009《酵母抽提物》指出：酵母抽提物是以食品用酵母为主要原料，在酵母自身的酶或外加食品级酶的作用下，酶解自融(可再经分离提取)后得到的产品，并富含氨基酸、肽、多肽等酵母细胞中的可溶性成分。不同的生产方法得到的酵母抽提物也各有不同，传统酵母抽提物的提取方法有自溶法、酶解法、酸解法3种。

酵母自溶是指利用酵母自身水解酶的作用，加入一定的自溶促进剂，控制一定的条件(温度、pH)，将酵母体内营养物质和大分子物质水解成为可溶性小分子物质的过程[10]。自溶法生产酵母抽提物的优点是成本较低、风味较好、游离氨基酸含量高，但呈味核苷酸含量较低[11]。酶解法是首先采用高温使酵母菌体内的酶失活，然后在外加酶如蛋白酶、核酸酶等的作用下使酵母细胞分解成小分子呈味物质，经过分离、干燥等处理得到酵母抽提物的方法[12]。该法的优点是有广泛的原料来源、提取的酵母抽提物的质量好，但是酶制剂的成本较高，因此主要用于高档酵母抽提物。酸解法是以干酵母为原料，利用盐酸或硫酸调节酸浓度，特定条件下水解一定的时间，然后进行过滤、脱色、去除异味、碱中和，最后浓缩或喷雾干燥得到酵母抽提物[13]。该法得到的酵母抽提物分解率高、游离氨基酸含量高，但适口性较差、成本较高。已有研究表明，酵母抽提物中的呈味肽具有增鲜提味的作用，是潜在的浓厚感肽的重要来源之一[14-16]。

呈味肽根据味觉特性分为酸味肽、甜味肽、苦味肽、咸味肽和鲜味肽五大类[17]。Kokumi 肽是后来新发现的，其概念易与鲜味肽混淆[18]。由于鲜味肽能够增强食物的鲜味和醇厚味，减少食盐和MSG的摄入[19-20]，而kokumi 肽本身不呈现基本味感，但是可以增强饱满、复杂性，增加可持续性[21]。因此，可以认为鲜味肽属于kokumi 肽的范围。

许多食品中都发现了 kokumi 肽，其主要来源于动物性食品、植物性食品、发酵食品、酵母提取物等。目前市场上较常见的是来自酵母抽提物中的kokumi肽。陈志颖等[22]利用啤酒废酵母制备富含谷胱甘肽的酵母抽提物，所得成品中GSH平均含量为4.11%，固形物含量达到61.87%。刘建彬等[23]在3种酵母抽提物的kokumi 物质研究中发现，导致其浓厚味感的主要滋味物质为<1000 kDa 分子量的寡肽(约70%)。Wang 等[24]利用超滤-纳滤(UFNF)联合工艺从酵母提取物中提取出谷胱甘肽。Liu 等[25]应用超滤、色谱、液质联用和感官分析技术，在酵母提取物中发现了10种kokumi活性肽，它们分别是γ-Glu-Cys-Gly、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Val、γ-Glu-Tyr、Leu-Lys、Leu-Gln、Leu-Ala、Leu-Glu、Leu-Thr和Ala-Leu，它们能赋予空白鸡汤典型的口感、持久和复杂的感觉(kokumi)。

2 酵母抽提物中kokumi 肽的评价标准

酵母抽提物中kokumi肽一般用感官评价法进行评价，该方法简单、直观、成本较低，但是对评价人员的能力要求较高，易受评价人员主观判断的影响。电子舌作为一种新型智能味觉仿生系统，能够方便有效地检测样品味觉信息，通常会将其与感官评价法联合使用作为某种物质的评价标准[26]。钙敏感受体(calcium sensing receptor， CaSR) 法一般用于医学研究中，在此用于kokumi 物质的检测中，根据是否激活CaSR以改变Ca2+的浓度来判断该物质是否为kokumi物质。综合使用以上几种评价方法有利于研究的准确性。

2.1 感官评价法

感官评价是通过视觉、嗅觉、触觉、味觉和听觉对样品进行测量、分析、解释的一种科学方法[27]。由于该方法直观、科学、简便，目前在市场上应用较为广泛。感官评定法在kokumi 物质中的应用，最初是由日本科学家提出来的，后来人们对其进行了改进和完善[28-30]。酵母抽提物中kokumi 肽的感官评价方法一般分为3个步骤：筛选感官评价人员，成立感官评价小组。小组成员一般10人以上，年龄在20～35岁，身体健康且无味觉障碍；对感官评价成员进行5种基本味觉的感知评价，采用空白鸡汤及加入谷胱甘肽的鸡汤进行kokumi 肽的味觉训练；安排具体的感官实验[31]。酵母抽提物中kokumi 肽的感官评价方法主要分为描述性感官评价和感官反馈评价。

描述性感官评价是指将样品加入到基础溶液或标准模型溶液中，让评价员用一些描述性词语如酸、甜、苦、咸、鲜、浓厚感、满口感、绵延感等来描述样品的味道[32]。待测样品的味道强度可以用5分法、9分法、10分法或15分法测量，味道强度由弱到强，基础溶液为0分，味道最强为最高分[33]。

感官反馈评价测试可细分为剂量反馈测试和时间反馈测试。剂量反馈测试为配制不同浓度梯度的样品加入到标准模型溶液或基础溶液中，采用评分制对基本味强度进行打分。计量反馈测试能够直观地看出样品浓度与基本味强度的关系。时间反馈测试是将一定浓度待测样品加入标准模型溶液中后，受试者在入口不同时间(如5，10 s)吐出并进行打分。该过程采用啜食技术，即待鉴评的溶液在口中旋转鉴评而不要咽下，每个样品测试完需用大量清水漱口，相邻样品溶液测试需要间隔一定的时间，以保证实验的准确性。时间反馈测试能很好地反映样品溶液在评价员口中的味道变化。

Kuroda等[34]应用感官评定方法发现，γ-Glu-Val-Gly的厚味强度是GSH的12.8倍，它增强了食物的口感、厚度(或浓味)和连续性，表明γ-Glu-Val-Gly是一种强浓厚感物质。Xu等对牛骨髓提取物(BBME)酶解产物的美拉德反应产物中鲜味和厚味活性肽进行了纯化鉴定和感官评价，发现Cys-Pro-Arg、Pro-Cys和Leu-Met能显著提高空白牛肉汤的浓厚味。Yang 等[35]借鉴该种感官评价法验证了具有kokumi活性的γ-谷氨酰基多肽能增强味精的鲜味，并在激活T1R3方面表现出协同作用。

2.2 电子舌分析法

电子舌(electronic tongue)又称味觉传感器，是一种新型的分析测试仪器，基于仿生学原理、传感器技术并结合计算机科学等多种新型技术手段，通过模拟人的味觉以实现对液体样品进行定性分析或定量测定的目的[36]。利用电子舌分析法测定kokumi物质，可与人类感官分析法结合，使评价结果更加可信。具体方法可参考吴阳的双孢菇中浓厚感呈味肽与基本味感相互作用的研究。将kokumi物质设置不同浓度梯度，分别添加到咸(氯化钠)、鲜(谷氨酸钠)、甜(蔗糖)、酸(柠檬酸)、苦(咖啡因)5种基本味感溶液中，对所配制的一系列溶液进行电子舌检测分析。结合感官分析发现，电子舌检测与感官分析结果规律保持一致：随着浓厚感肽浓度的增加，氯化钠溶液的咸味强度、谷氨酸钠溶液的鲜味强度、蔗糖溶液的甜味强度均为先增强再减弱，柠檬酸溶液的酸味强度逐渐减弱，咖啡因溶液的苦味强度先减弱再增强。

2.3 钙敏感受法

2.3.1 CaSR 结构

2009年，Gabriel等[37]首次在哺乳动物中发现味觉组织中的钙敏感受体(calcium sensing receptor，CaSR)，并提出CaSR作为受体，根据其表达的细胞类型和可用的信号转导级联来检测Ca2+和可能的其他味道。随后，Ohsu 等的研究表明，CaSR激动剂在味觉细胞中被CaSR识别，并在人体中产生令人满意的kokumi味觉，这是第一份表明CaSR在人类味觉感知中独特功能的报告。2012年，Maruyama等[38]在舌组织切片和共聚焦显微镜下使用了加载钙离子荧光探针Calcium Green-1的小鼠味觉细胞。 在味觉孔周围局部施用kokumi物质，诱导一部分味觉细胞的细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)增加，这些反应被CaSR抑制剂NPS-2143预处理所抑制。研究结果进一步表明表达CaSR的味觉细胞是kokumi物质的主要检测者，并且它们是独立于甜味和鲜味受体的。

人源CaSR(NCBI：000379.2)属于C 类的G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors，GPCR)，由1078个氨基酸组成，它在哺乳动物细胞外钙稳态中起核心作用[39-40]。CaSR由GPCR家族的3个特征结构组成：细胞外N端Venus Flytrap结构域(VFTD)、TMD和富含半胱氨酸的结构域(CRD)[41]。从结构上看，人类CaSR与甜味和鲜味受体相似，但不同之处在于它是同二聚体而不是异二聚体[42]。

2.3.2 CaSR检测法

目前，使用钙敏感受体(CaSR)法评估kokumi 物质主要采用卵母细胞和HEK-293细胞两种受体。以卵母细胞为例简述如下：CaSR激动剂诱导的电流用显微注射hCaSR-cRNA的卵母细胞来表征。卵母细胞是从非洲爪蛙卵巢中获得的，然后用hCaSR 的互补RNA显微注射。卵母细胞中表达的CaSR(Gq类G蛋白偶联受体)的激活导致细胞间Ca2+的增加。游离钙离子的增加会激活卵母细胞内源性钙依赖性氯离子通道，同时产生可测量的电流。CaSR激活剂通过两个电极刺穿卵母细胞产生电流，记录的峰值电流被认为是受体激活的强度。Amino等通过检测 γ-谷氨酰肽的CaSR活性，以此辅助验证具有CaSR活性的γ-谷氨酰肽的结构[43]。

除了kokumi 物质，阳离子、多胺、氨基酸、多肽等也可激活CaSR[44-46]。因此，激活CaSR的不一定就是kokumi 物质，CaSR法仅能对kokumi 物质初筛，结合感官评定法和电子舌分析法将加大kokumi 物质检测的准确性。

3 Kokumi肽呈味机制

Ohsu等首次报道了kokumi肽(GSH、γ-Glu-Val-Gly和各种γ-谷氨酰肽)通过CaSR发出信号，并能与甜味、咸味和鲜味协同作用，以增强kokumi感觉。通过使用异源表达系统和人类感官分析，kokumi肽通过CaSR赋予甜味、咸味和鲜味kokumi感觉。

谷胱甘肽(GSH)和谷氨酰肽被认为在与L-氨基酸相同的位点与CaSR变构结合，并在0.5～1 mmol/L游离钙的存在下增强其活性，从而作为正变构调节剂[47-48]。通过对大量γ-谷氨酰肽-CaSR-活性关系的不断研究，Amino等确定了γ-谷氨酰肽的强CaSR活性的结构要求如下：氨基末端 γ-L-谷氨酰残基的存在； 在具有 L构型的第二个残基上存在中等大小的脂肪族中性取代基；羧基末端羧酸的存在，优选甘氨酸作为第三组分的存在。通过使用CaSR活性分析筛选的 γ-谷氨酰肽的感官分析，发现γ-谷氨酰缬氨酰甘氨酸是有效的kokumi肽。此外，含有正缬氨酸的γ-谷氨酰肽具有极好的kokumi物质的感觉活性。

CaSR的整个N端胞外结构域(ECD)的静止构象和活性构象的晶体结构提供了关于Ca2+和L-氨基酸结合之间的动力学的额外信息。通过使用L-色氨酸(L-Trp)，该研究提供了L-氨基酸是CaSR共激动剂的直接证据，它们与Ca2+协同作用，实现受体的完全激活，示意图见图1。具体有以下几点原因：它在细胞外的捕蝇草模块(VFT区)的域间缝隙结合，这是C类GPCRs的典型激动剂结合位点；L-Trp与代谢型谷氨酸受体(mGluRs)和γ-氨基丁酸受体(GABAB)的内源性激动剂具有共同的受体结合模式，它们也是氨基酸或其类似物。参与激动剂识别的残基位于这些受体结构的相同位置；L-Trp与LB1和LB2结构域相互作用，促进胞外结构域的关闭，这是CaSR激活过程中至关重要的第一步。相反，在假定的构型激动剂结合位点没有发现Ca2+来诱导结构域关闭；L-Trp结合残基的突变完全阻断了Ca2+诱导的IP积累和细胞内Ca2+动员，表明L-Trp是Ca2+介导的受体反应所必需的；L-Trp 在细胞外Ca2+存在下直接激活CaSR介导的胞内Ca2+动员。

图1 CaSR的激活机制[49]Fig.1 Activation mechanism of CaSR

Liu等开发了一种创新的基于无细胞 Förster 共振能量转移(FRET)构象 CaSR 生物传感器，以阐明与激活相关的主要构象变化。通过对环境营养物质的完美控制，该测定结果表明单独的 Ca2+完全稳定了活性构象，而氨基酸则表现为纯正变构调节剂[50]。Ling 等进一步使用单粒子低温电子显微镜确定了处于非活性状态、Ca2+或L-Trp结合状态和Ca2+/L-Trp结合活性状态的全长人源CaSR的结构。 L-Trp结合诱导CaSR的金星捕蝇草(VFT)结构域关闭，使受体进入中间活性状态。Ca2+结合将VFT结构域的构象变化传递到跨膜区(TMDs)，从而诱导二聚CaSR的两个TMDs之间的紧密接触，激活受体。

4 Kokumi肽信号转导

味觉检测的解剖单位是味觉受体细胞，它们被组装成味蕾，分布在舌和腭上皮的不同乳头状突起上[51]。味蕾细胞可以根据它们的功能分为3种主要类型。一般来说，苦味、甜味和鲜味刺激由Ⅱ型细胞检测，酸味刺激由Ⅲ型细胞检测，咸味(氯化钠)刺激由尚未确定的味蕾细胞检测[52]。其中，甜味、苦味和鲜味是由GPCRs介导的:甜味细胞使用TAS1R2和TAS1R3的异二聚体(TAS1R2/3)来检测天然和人工甜味剂，鲜味细胞使用TAS1R1和TAS1R3的异二聚体(TAS1R1/3)来检测各种L-氨基酸和核苷酸，人类和小鼠的每个苦味细胞分别表达约25～35个TAS2Rs，以检测大量的、化学上不同的苦味物质[53]。

图2 CaSR信号转导通路Fig.2 CaSR signaling pathway

Kokumi 味觉是由另一种GPCR-CaSR转导的、CaSR-配体结合和G蛋白的募集导致复杂的扩增信号网络的激活，从而启动许多细胞内功能。CaSR的功能多样性源于其激活多种Gα蛋白(Gq/11、Gi/o、G12/13和Gs)的能力[54]，随后影响与甲状旁腺激素分泌、癌症和转移的病理生理学相关的多种信号通路[55-56]。

目前对于CaSR信号转导的研究主要集中于药理学，对于味觉信号转导的研究相对较少，结合几种基本味觉信号传导及对mGlus的研究，可以预测kokumi 肽激活CaSR的信号通路与GPCR介导的Ca2+信号通路类似。以Gα-q偶联的GPCR为例，kokumi底物激活CaSR，并通过Gα-q/11蛋白传递信号，Gα-q/11蛋白进一步激活磷脂酶C(PLC)，使其催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)水解并产生双二信使：1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油(DAG)。IP3作用于内质网(ER)上的IP3受体，释放细胞内的Ca2+[57]。Kokumi途径是否严格依赖于Gα-q/11蛋白，或者也可以像其他味觉方式一样使用Gα-味导素进行下游信号传导，仍然需要更多的研究进行验证。

5 酵母抽提物在食品中的应用

酵母抽提物在食品中可应用调味品、饮料、肉制品和功能性食品中，其种类、添加比例及应用效果见表1。酵母抽提物由于含有大量氨基酸、多肽、核苷酸等物质，常用于如酱油、鸡精、火锅底料、方便面料包等调味品中。酵母抽提物在酱油中主要可去除酱油中的豆腥味和杂味，尤其可以减少食盐的用量。李沛等[58]通过酱香型酵母抽提物协助酱油减盐，发现酱香型酵母抽提物可协助减盐20%～30%，其风味及盐味与减盐前差别不大。鸡精、火锅底料及方便面料包中加入酵母抽提物可提升其鲜味及浓厚感，黎怡林等[59]通过对比实验、感官评价的方法，发现添加 2%肉汤味型酵母抽提物的鸡精产品，在气味、鲜味、肉质感、复杂感、持久感、饱满度方面要明显优于添加 2%普通型酵母抽提物的鸡精产品，而添加 2%普通型酵母抽提物的鸡精产品又明显优于未添加酵母抽提物的鸡精产品。酵母抽提物应用在果汁、果茶、食醋中还能起到降低酸味和涩味的作用，提升使产品口感更加协调，整体喜好度。

表1 酵母抽提物在传统食品中的应用Table 1 Application of yeast extract in traditional food

续 表

酵母抽提物应用于肉制品中可使产品香气纯正、浓郁、圆润，与其他呈味物质产生协同效应, 添加后可减少其他调味料，降低成本[85-86]。美拉德反应是肉制品风味产生的一个重要途径, 酵母抽提物中富含蛋白质、氨基酸、肽类物质等成分,其与含硫化合物、还原糖、HVP及肉提取物等物质共热, 在优化条件下产生很强的肉香味[87-88]。黎彩平等通过对加入酵母抽提物的广式腊肠进行分析，发现其氮含量有所增加，气味和滋味(腊香味)均比不加酵母抽提物时有所提高。李库等研究发现在酱牛肉中添加0.5%的风味型酵母抽提物(TB01)后产品质量提高，香气丰满浓郁、回味悠长，口感鲜嫩爽口,细腻柔软。酵母抽提物应用于鸡肉肠、速冻包子馅、鱼糜制品中均有增鲜、提高浓厚感的作用。随着近两年植物肉市场的火热，也有人将酵母抽提物加入植物肉中，结合肉味香精，用纯素原料做出具有肉味口感与风味的植物肉汉堡。

酵母抽提物不仅在滋味方面有广泛的应用，在功能性食品中也有很大的市场。日本科学家已经研发出了一款高谷胱甘肽含量的酵母抽提物，作为营养补充剂添加于功能性食品和保健品中。朱明军等利用维生素C、酵母抽提物、虾青素及辅料开发了一种含虾青素的营养食品，专供人类营养和保健需要。丁红莉等利用嗜热链球菌grx02、酵母抽提物及牛磺酸开发了一种具有醒酒护肝作用的保健食品，其中酵母抽提物中富含谷胱甘肽，可以提高肝组织的抗氧化能力，增强肝细胞活力，增强肝细胞代谢能力，达到解酒护肝的目的。胶原蛋白饮品中酵母抽提物能使其他各种原料中的氨基酸、肽、蛋白质、糖类在加工和储存过程中发生美拉德反应，对成品色泽、风味的形成与提高有着非常重要的作用。施小辉以酵母抽提物为主要原料，结合胶原蛋白、水苏糖等物质开发了一种谷胱甘肽口服液，并采用等渗等压技术提高人体对谷胱甘肽的吸收率，改善肌肤暗沉、暗黄、黄褐斑、晒斑等问题，使皮肤白皙细腻，并增强机体免疫力。

6 展望

随着人们对食品风味和质量要求的提高，减盐、减糖、减脂逐渐成为市场的趋势。Kokumi 肽能与其他呈味物质相互作用从而引起味觉方面的浓厚感、持久性与复杂感，添加少量到食品中即可达到减盐、减糖的效果，这使得酵母抽提物中kokumi 物质在调味领域具有很好的开发潜力。因此，kokumi 物质有希望成为一种新的健康食品价值来源。但关于kokumi在未来趋势上的研究还有许多不足，制备方面：目前我国对kokumi 肽的研究开发停留在实验室的分离鉴定上，kokumi 肽的制备技术尚未成熟，常见的化学合成方法成本极高。未来可利用现有的生物工程技术实现 kokumi 肽的产业化生产，并有目的地合成、改造或设计 kokumi 肽[89]；机制研究：目前kokumi肽主要通过感官、细胞实验、计算机模拟、冷冻电镜等手段进行分析，未来需要大量研究人员通过不同手段进一步研究kokumi 肽的呈味机制和信号传导机制；与其他基本味觉相互作用：kokumi肽是通过对其他基本味觉进行加强来发挥作用的，该类物质是否对基本味觉受体及其传导途径产生影响也有待研究；与其他感官的联系：味觉信号并非是孤立存在的，它与其他感觉如嗅觉、视觉等及神经信号之间是否有某种联系，也是未来可以研究的方向。