UPLC-Q-TOF-MS法分析僵蛹和僵蚕化学成分差异

邢东旭， 李庆荣， 肖 阳， 赵超艺， 杨 琼*

(1.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东 广州 510610；2.岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心，广东 茂名 525000)

僵蚕是一种优良的动物类中药材，具有息风止痉、祛风止痛、化痰散结的功效[1]，临床应用广泛[2-3]。9%～9.6%成人用药含僵蚕，儿童用药中含僵蚕的比例则高达40%～45.3%[4]。僵蚕水提物或醇提物具有抗惊厥、抗癫痫、抗凝血等多种药理活性[5-7]。

僵蚕年需求量在3 000吨左右，主要来自蚕区收集的病死僵蚕[8]。随着蚕病防治技术的进步，僵病的发生得到有效控制，造成僵蚕原料日趋紧缺[9]。草酸铵是僵蚕重要活性成分之一，经皮接种活蛹生成的僵蛹与僵蚕草酸铵含量相似[10]。另外，临床上发现用僵蛹配伍全蝎、蜈蚣、天麻等治疗乙型脑炎有高热抽搐患者的疗效与僵蚕相同[11]。如能以僵蛹作为僵蚕的代用品，既解决僵蚕供应，又实现蚕蛹的高值化利用[12]。然而，目前对僵蛹和僵蚕化学成分和疗效的差异还缺乏全面认识。鉴于此，本研究拟采用UPLC-Q-TOF-MS技术分析僵蛹和僵蚕化学成分的差异，并比较两者的抗惊厥作用，为僵蛹作为僵蚕的代用品提供更多依据。

1 材料

僵蛹和僵蚕由本实验室人工生产获得。白僵菌菌株为球孢白僵菌BeauveriabassianaJC-1，家蚕品种为四元杂交种“两广二号”。将白僵菌孢子液分别喷体感染5龄起蚕和化蛹第4天的蚕蛹，自然死亡后继续僵化10 d后采收，100 ℃处理0.5 h使病原全部失活，后经60 ℃烘干至水分质量分数<13%，粉碎后过100目筛备用[13]。

Waters Q-TOF Premier飞行时间质谱(美国沃特世公司)；TYSP-100高速多功能粉碎机(浙江省永康市红太阳机电有限公司)；真空抽滤机(巩义市予华仪器有限公司)；小鼠灌胃针(北京合力科创科技发展有限公司)；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)；甲酸、甲醇(赛默飞世尔科技公司)。

2 方法

2.1 供试品溶液制备 称取100 mg样品，加1 mL溶剂(甲醇∶水=8∶2)，冰水浴超声处理5 min，冷冻离心(4 ℃，16 000 g)15 min，取上清液。重复提取1次，合并上清液，用0.22 μm微孔滤膜滤过。

2.2 提取物制备 称取僵蛹粉或僵蚕粉100 g，热水回流提取2次，每次1 h，提取液过滤后真空浓缩，经冷冻干燥获得僵蛹水提物或僵蚕提取物，用于抗惊厥小鼠实验。

2.3 分析方法 色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，流动相0.1%甲酸(A)-0.1%甲酸甲醇(B)(0～0.5 min，2%B；0.5～1.5 min，2%～40%B；1.5～9.5 min，40%～80%B；9.5～13 min，80%～100%B；13～13.4 min，100%～2%B；13.4～15.5 min，2%B)，梯度洗脱；体积流量0.38 mL/min；柱温50 ℃；进样量3 μL。采用ES+模式；离子源温度115 ℃；毛细管电压3 000 V；脱溶剂气温度350 ℃；气体体积流量600 L/h；锥孔电压35 V；锥孔气体积流量50 L/h。质谱扫描范围m/z50～1 000，质谱扫描时间为0.3 s，扫描间隔为0.02 s。

2.4 数据处理 通过Mass Lynx 4.1软件包的Data Bridge软件将原始质谱数据转化为Net CDF格式，在R软件中采用XCMS和CAMERA软件包对进行质谱数据预处理，用Excel软件对所有样品进行归一化，将归一化的数据导入SIMCA 软件进行多维统计分析，包括主成分分析和正交偏最小二乘法判别分析。采用Welch’s t test对正态分布数据进行参数检验，而对于非正态分布数据则采用Wilcoxon Mann-Whitney test进行非参数检验。

2.5 差异化学成分鉴定 根据OPLS-DA模型第一主成分的变量重要投影(VIP)>1并结合非参数检验 Mann-Whitney U test 的P<0.05来筛选差异化学成分。基于自建数据库及代谢物信息公共数据库，根据一级质谱的精确m/z并辅助二级质谱碎片信息对差异化学成分进行定性并基于标准品或文献报道对部分差异成分进行确认。脂类成分通过和脂质理论库比对后获得。

2.6 小鼠分组与给药 雄性SPF级昆明小鼠，18～22 g。购入后适应性喂养3 d，然后将小鼠随机分为4组，对照组、模型组、僵蛹组和僵蚕组，每组10只。用无菌水将水提物溶解，给药组按照预设剂量(生药20 g/kg)灌胃给药，对照组和模型组给予等体积的无菌水，连续灌胃5 d。第6天给药30 min，除对照组外，各组小鼠均腹腔注射1.6 mg/kg士的宁注射液。

2.7 小鼠惊厥反应观察 持续观察30 min，记录小鼠的阵挛潜伏期(Ⅰ-Ⅲ级的发作时间)、强直性惊厥潜伏期(Ⅴ级发作)和30 min内小鼠死亡的只数，通过视频监控小鼠痫性发作过程。小鼠惊厥反应的观察参照Racine标准。0级无反应；Ⅰ级节律性口角、耳或面部肌肉抽动阵挛；Ⅱ级点头并伴随更严重的面部肌肉抽动阵挛；Ⅲ级出现前肢阵挛但不伴随直立；Ⅳ级前肢阵挛伴随直立；Ⅴ级全身强直阵挛发作而跌倒[14]。

3 结果

3.1 化学成分 僵蛹和僵蚕的UPLC-Q-TOF-MS基峰强度(BPI)色谱图见图1。采用PCA无监督模式识别对僵蛹和僵蚕样品的差异进行分析。从PCA 模型(图2A)可以看到，僵蛹和僵蚕样品有明显的区分，僵蚕组内样品间的变异性稍大。为了达到最大化分离和寻找差异性成分，建立有监督模式识别方法OPLS-DA模型(图2B)，发现僵蛹与僵蚕分别处于左右两侧，说明两组样品能被显著区分。结果表明僵蛹和僵蚕在化学成分上存在显著差异。

3.2 差异化学成分鉴定与分析 寻找贡献值较大的变量，OPLS-DA 载荷图结合VIP>1及P<0.05作为标准筛选差异化学成分。共筛选出46种差异化学成分。由表1可知，19种化学成分含量显著减少，其中脂类物质有11种，为甘油三酯(TG)与山奈酚-7-O-β-D-4-O-甲基葡萄糖苷、山柰酚、桑色素等3种黄酮类。27种化学成分含量显著增多，其中脂类物质有20种，主要为甘油二酯(DG)、单酰甘油(MG)、磷脂酰胆碱(PC)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)和游离脂肪酸(FFA)，以及甜菜碱、腺嘌呤、L-左旋肉碱、胆碱、乙酰肉毒碱等。

表1 僵蛹和僵蚕差异性化学成分

注：a为标准品比对，b为数据库比对，c为文献报道。差异倍数计算方法为两组数据均值之比的对数，正值表示该物质在僵蛹中的水平高于僵蚕，负值则相反。

3.3 僵蛹和僵蚕抗惊厥效果比较 通过士的宁致痫小鼠模型对僵蛹和僵蚕水提物的抗惊厥效果进行比较，结果见表2。与模型组比较，僵蚕水提物能够延长小鼠阵发性痉挛发作潜伏期(P<0.01)，提高小鼠的死亡保护率。僵蛹水提物能够延长小鼠阵发性痉挛发作潜伏期(P<0.01)，还可以提高小鼠的死亡保护率(P<0.001)。30 min内僵蚕组和僵蛹组分别有2只和3只小鼠未出现强直阵挛反应，两组其它小鼠平均强直潜伏期较模型组均延长。僵蛹和僵蚕水提物均有抗惊厥作用，且僵蛹水提物对士的宁致痫小鼠的治疗效果更好。

表2 僵蛹和僵蚕对士的宁致痫小鼠效果

4 讨论

2018年全国蚕茧产量67.9万吨，估算每年的蚕蛹产量在50万吨以上。由于一直将蚕蛹作为缫丝工业的副产品，蚕蛹资源未得到很好地利用[9,11]。有报道僵蛹可以作为僵蚕的代用品，但由于对僵蛹和僵蚕化学成分差异缺乏整体了解，对僵蛹的抗惊厥效果研究较少，僵蛹作为中药材僵蚕的代用品尚未得到足够的认可。UPLC-Q-TOF-MS是近年来发展起来的具有高效分离和定性检测综合能力的分析方法，在中药化学成分分析等研究中已得到较多应用[15-17]。

PCA和OPLS-DA分析结果表明，僵蛹和僵蚕的化学成分存在显著差异，僵蛹中TG含量减少，DG、PC、LPC和FFA含量增多。与白僵菌将蚕(蛹)体脂肪水解为游离脂肪酸供其生长所需有关[18]。此外，山奈酚、山奈酚-7-O-β-D-4-O-甲基葡萄糖苷和桑色素等黄酮类成分含量下降。山柰酚、槲皮素和桑色素等是蚕体中主要的黄酮类物质，来自于桑叶黄酮在蚕体中的积累[19]。山柰酚-7-O-β-D-4-O-甲基葡萄糖苷是僵蚕僵化反应的特征成分，白僵菌能够以蚕体中的山柰酚为底物发生4-O-甲基葡萄糖苷化反应，生成山柰酚-7-O-β-D-4-O-甲基葡萄糖苷[20]。另外，僵蛹中甜菜碱、腺嘌呤、L-左旋肉碱和胆碱成分含量有所增加。

通过士的宁致痫模型小鼠对僵蛹和僵蚕抗惊厥效果进行评价，发现僵蛹和僵蚕水提物均有抗惊厥作用，且僵蛹水提物在延长小鼠阵发性痉挛发作潜伏期和提高小鼠死亡保护率方面的效果更好。为僵蛹作为僵蚕代用品提供了重要理论依据。