八味沉香散对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

李永慧， 朱 琳， 寇毅英， 李永芳*

(1.青海省西宁市第一人民医院，青海 西宁 810000；2.青海大学医学院，青海 西宁 810001)

近年来，急性心肌梗塞的发病率与死亡率明显上升，严重威胁人类的生命健康[1-2]。迅速恢复血供，即再灌注治疗是挽救急性心肌梗死的根本措施。但恢复血供又可造成或加重心肌细胞的损伤，即心肌缺血再灌注损伤，成为再灌注疗法获益的主要障碍[3-4]。因此，寻找安全有效的治疗药物，提高急性心肌梗塞的再灌注治疗疗效，显得尤为重要。藏药八味沉香散具有消心热、宁心安神、醒脑开窍之功效，是藏医临床治疗冠心病心绞痛的经典常用藏医药方。研究发现，八味沉香散能明显改善异丙肾上腺素和垂体后叶素引起的心肌缺血损伤[5-7]，但其对心肌缺血再灌注损伤是否也具有保护作用还待进一步研究。本实验拟采用在体冠状动脉结扎法建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，研究八味沉香散抗心肌缺血再灌注损伤作用，以期为八味沉香散防治心肌缺血再灌注损伤提供实验依据，开拓藏药在治疗缺血性心脏病的领域。

1 材料

1.1 动物 健康SD大鼠，清洁级，体质量220～280 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK (陕) 2017-003。

1.2 试剂与药物 八味沉香散(批号20171107)，购自西藏神猴药业有限责任公司，取适量用蒸馏水分别配置成0.4、0.8、1.6 g/kg药液(低、中、高剂量)，备用。肝素钠(批号170512)，购自北京博奥拓达科技有限公司；2,3,5三苯基氯化四氮唑(TTC)(批号922G037)，购自北京索莱宝科技有限公司；乌拉坦(批号130412)，购自国药集团化学试剂上海有限公司；乳酸脱氢酶 (LDH)、肌酸激酶 (CK)试剂盒(批号20170025)，购自南京建成生物工程研究所。

1.3 仪器 DHX-150型动物呼吸机，购自成都仪器厂；Powerlab型数据采集分析系统，购自澳大利亚AD Instruments公司；723P型紫外-可见分光光度计，购自上海光谱仪器有限公司；水浴锅，购自上海医大仪器有限公司；TGL-16gR型高速离心机，购自上海安亭科学仪器厂。

2 方法

2.1 分组与给药 大鼠随机分为假手术组、模型组和八味沉香散低、中、高剂量组(0.4、0.8、1.6 g/kg)，每组10只。八味沉香散各剂量组大鼠灌胃给予相应剂量八味沉香散药液，假手术组和模型组灌胃给予等量蒸馏水，每天1次, 连续10 d。末次灌胃后1 h，除假手术组大鼠不结扎左冠状动脉外，其余各组大鼠均行心肌缺血再灌注损伤。

2.2 缺血再灌注模型制备 大鼠以20%乌拉坦 (0.4 mL/100 g) 腹腔注射麻醉，仰位固定，四肢皮下插入针式电极，持续记录肢体二导联心电图，切开气管、插管并连接动物呼吸机(频率70～80次/min，潮气量 2～3 mL/100 g，呼吸比 2∶1)，稳定10 min后，开胸、剪开心包、暴露心脏，于左心耳下缘肺动脉圆锥旁以6-0无创缝合线穿过左冠状动脉前降支(LAD)，稳定10 min后，结扎左冠状动脉，以心电图ST段抬高或T波高耸作为结扎成功的标志，心肌缺血30 min后打开结扎线进行复灌，抬高的ST段降低或高耸的T波恢复表示心肌再灌注成功，再灌注60 min，制备大鼠心肌缺血再灌注模型。

2.3 血清LDH、CK活性检测 大鼠心肌缺血再灌注结束后，腹主动脉取血，3 000 r/min离心15 min，取血清，置于-80 ℃冰箱保存，按试剂盒说明检测血清LDH、CK活性。

2.4 心肌梗死范围检测 大鼠腹主动脉取血后，摘取心脏，剔除血管、脂肪等非心肌组织，滤纸吸去心表水分。平行房室沟，将心脏切成1.5～2.0 mm薄片，共5片，切片在37 ℃预温的含1% TCC的Tris-HCl缓冲液中染色15 min，取出切片以4%甲醛溶液固定1 h，正常心肌呈红色，梗死心肌呈灰白色，分别称定正常、梗死心肌质量，计算梗死心肌占整个心肌(梗死心肌与正常心肌之和)的质量百分比, 即心肌梗死范围。

2.5 心肌组织病理学检测 每组取4只大鼠，心肌缺血再灌注后取心脏，置于10%甲醛溶液中固定，石蜡包埋、切片，进行HE 染色，光学显微镜下观察心肌组织形态学变化。该实验由青海省康乐医院完成。

2.6 心肌超微结构观察 每组取4只大鼠，心肌缺血再灌注后取心脏，样品经3%戊二醛预固定，1%四氧化锇再固定，丙酮逐级脱水，Epon812包埋，半薄切片光学定位，超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅双重染色，日立H-600IV型透射电镜观察。该实验由四川大学华西医学检测所完成。

3 结果

3.1 八味沉香散对缺血再灌注大鼠血清LDH、CK活性的影响 如表1所示，与假手术组比较，模型组大鼠血清LDH、CK活性升高(P<0.01)；与模型组比较，八味沉香散各剂量组大鼠血清LDH、CK活性降低(P<0.05，P<0.01)。

表1 八味沉香散对大鼠血清LDH、CK活性的影响

3.2 八味沉香散对缺血再灌注大鼠心肌梗死范围的影响 如表2所示，与假手术组比较，模型组大鼠心肌梗死范围增加(P<0.01)；与模型组比较，八味沉香散中、高剂量组大鼠心肌梗死范围减少(P<0.05，P<0.01)，八味沉香散低剂量组大鼠心肌梗死范围减少，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 八味沉香散对缺血再灌注大鼠心肌梗死范围的影响

3.3 八味沉香散对缺血再灌注大鼠心肌组织病理学的影响 如图1所示，假手术组大鼠心肌组织无变性、坏死，间质未见水肿及炎细胞浸润；模型组大鼠心肌细胞横纹不清晰，部分心肌纤维断裂，心肌间质可见炎细胞浸润，水肿明显，血管扩张，心肌组织有点片状坏死，可见灶性出血；与模型组比较，八味沉香散各剂量组大鼠心肌细胞核大致正常、心肌纤维排列基本整齐，心肌间质炎症细胞浸润减少，细胞间隙水肿减轻, 低剂量组心肌组织有少量点状坏死和出血，中、高剂量组大鼠心肌组织未见坏死；且八味沉香散高剂量组大鼠心肌纤维损伤、间质炎症细胞浸润、细胞间隙水肿等病变情况较低、中剂量组更轻。

3.4 八味沉香散对缺血再灌注大鼠心肌超微结构的影响 如图2所示，假手术组大鼠心肌细胞的结构正常，肌膜完整，心肌纤维排列有序，线粒体结构清晰、完整；模型组大鼠心肌细胞结构异常，胞浆内线粒体明显肿胀，呈现空泡化，部分肌纤维有溶解；八味沉香散低、中剂量组大鼠心肌细胞受损比模型组轻，但部分线粒体出现肿胀；八味沉香散高剂量组大鼠心肌细胞结构基本正常，线粒体结构清晰与假手术组比较无明显差异。

4 讨论

再灌注是治疗急性心肌梗塞的主要措施，但大量研究表明，再灌注不一定会使缺血损伤的组织细胞得到恢复，在一定条件下反而造成或加重心肌细胞的损伤[8]，即心肌缺血再灌注损伤。药物预/后处理、缺血预/后处理、远距离缺血预处理等措施可以有效减轻心肌缺血再灌注的损伤程度，缩小损伤范围[9-11]。但急性心肌梗塞发生的不可预知性限制了缺血预/后处理、远距离缺血预处理在再灌注治疗中的实际应用，相比较而言，药物预/后处理具有较安全、使用方便、易控制等优点，因此，开发安全有效的抗心肌缺血再灌注损伤药物具有重要意义。

八味沉香散收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·藏药》，气芳香，味咸、涩、微苦，具有活血止痛、清心热、养心、安神、开窍的功效，是藏区临床广泛用于治疗冠心病、心绞痛的藏成药[12]。现代研究发现，八味沉香散水提液、95%醇提物、50%醇提物能明显改善异丙肾上腺素和垂体后叶素引起的大鼠心电图、血流动力学、血清酶和组织病理学改变，减轻线粒体结构损伤[5-7]。本研究通过冠状动脉结扎法建立在体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，探讨了八味沉香散对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。

心肌细胞内有大量的CK和LDH，当心肌发生缺血再灌注损伤时，心肌细胞膜通透性增加，心肌中大量CK、LDH释放到血液，使血清中CK、LDH水平升高，导致活性增高，因此，血清中CK、LDH活性可反映心肌细胞受损程度[9]。本实验结果显示，与模型组比较，八味沉香散各剂量组大鼠血清CK、LDH活性均降低，说明八味沉香散可在一定程度上减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤，减少心肌细胞CK、LDH的漏出。

心肌梗死范围是评价心肌缺血再灌注损伤程度的一个重要指标。本实验结果显示，八味沉香散预防给药能降低大鼠心肌缺血再灌注引起的心肌梗死范围，改善心肌缺血再灌注损伤中心肌组织的炎细胞浸润、水肿及心肌细胞结构改变，进一步证实了八味沉香散对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。

线粒体是细胞能量产生的重要细胞器，是缺血再灌注损伤的关键靶点，已经成为心肌损伤的关键参与者和调节者[13]，主要表现为三磷酸腺苷合成减少、活性氧产生过多、Ca2+超载及心肌细胞的凋亡等，进一步损伤线粒体及心肌细胞结构和功能[14]，也成为中医药治疗的重要靶点[15-16]。本实验结果显示，八味沉香散能减轻大鼠心肌缺血再灌注引起的线粒体肿胀、空泡和结构改变，说明八味沉香散抗大鼠心肌缺血再灌注损伤作用可能是通过保护心肌线粒体而发挥的，但保护线粒体的分子机制有待进一步研究。