黄精多糖对糖尿病小鼠的降血糖作用及机制

曾 立， 向 荣， 张运良， 傅春燕， 李庚喜， 李成舰

(1.邵阳学院，湘西南中药开发利用湖南省工程研究中心，湖南 邵阳 422000；2.邵阳学院图书馆，湖南 邵阳 422000)

随着生活方式和饮食结构的改变，我国糖尿病患者数已达1.14亿，糖尿病逐渐成为亟待解决的严重公共卫生问题[1-2]。糖尿病显著特征之一是空腹血糖值高于6.1 mmol/L或餐后2 h血糖值高于7.8 mmol/L，同时伴随饮水增多、排尿增多、进食增多且体重消瘦的“三高一低”特征[3-5]。现有的双胍类、格列奈类等六大类降血糖药物虽已在临床实验中表现出了较好的降糖效果，但依然出现了诸如增加心血管疾病风险、胃肠道毒性等不良副反应[6]。因此，开发天然低毒性且具有良好抵御血糖升高的中药对于防治糖尿病具有重要意义。已有研究表明，罗汉果苷可降低空腹血糖水平，同时改善血清中总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平，其降糖机制可能与恢复血脂水平有关[7]。黄芪甲苷提高了超氧化物歧化酶(SOD)的活性，同时抑制脂质氧化增加谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，从而发挥降血糖作用[8]。人参皂苷可能通过上调肝脏GSY等蛋白表达促进糖原合成，维持机体葡萄糖代谢稳态[9]。

黄精是常用的药食同源中药，具有多种生物活性物质，而黄精多糖是其主要活性成分之一。现有研究探讨了黄精多糖提取物的降血糖效果[10-11]，但缺乏其对糖尿病动物模型肝组织糖代谢的影响。本研究以链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病小鼠模型，探究黄精多糖的降血糖效果及机制，为黄精多糖的深加工利用以及药食同源中药的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级昆明小鼠，体质量(20±2) g，共70只，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号SCXK(湘)2020-0002，所有小鼠均按照邵阳学院学术委员会啮齿类动物饲养标准进行处理。

1.2 试剂与药物 黄精多糖(纯度86.4%，批号J001982)购于上海将来实业股份有限公司。盐酸二甲双胍片、STZ(批号AAW1402、S0130)购于美国Sigma公司；TC、TG、SOD、GSH-Px、MDA和肝糖原(HG)试剂盒购于南京建成生物工程研究所；E.Z.N.A Total RNA Kit试剂盒(批号R6688-01)购于美国Omega公司；FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix试剂盒、SYBR Green试剂盒(批号KR118、FP209)购于天根生化科技(北京)有限公司；β-actin、葡萄糖转运蛋白-2抗体(GLUT2)、糖原合成酶激酶3β抗体(GSK-3β)；磷酸化糖原合成酶激酶3β 多抗体(p-GSK-3β)、磷脂酰肌醇1,2,3,4,5,-五磷酸抗体(PIP5K)、蛋白激酶B抗体(Akt)、磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)、辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗鼠抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔抗体(批号66009-1-Ig、66846-1-Ig、22104-1-AP、14850-1-AP、55028-1-AP、16754-1-AP、22371-1-AP、SA00001-1、SA00001-2)均购于美国Proteintech公司。

1.3 仪器 多功能酶标仪、荧光定量RCP仪和高速匀浆机(美国Thermo公司)；5810型台式冷冻离心机(德国Eppndorf公司)；电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；HH型数显恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；立式压力蒸汽灭菌锅(上海医用分析仪器厂)；UV-2550型紫外分光光度计(日本岛津公司)；QuantStudio6型RCP仪(美国Lifetech公司)；电泳槽(北京六一生物科技有限公司)。

1.4 造模 小鼠适应性饲养7 d，禁食16 h后测量空腹血糖值和体质量，根据体质量连续5 d腹腔注射50 mg/kg STZ溶液，每天1次，最后1次注射STZ后，禁食16 h并再次测定血糖值。同时，记录造模期间小鼠的血糖值、饮水量、进食量和体质量。

1.5 分组及给药 小鼠随机分为6组，即正常组(生理盐水)、模型组(生理盐水)、二甲双胍组(250 mg/kg)及黄精多糖高、中、低剂量组(400、200、100 mg/kg)，除正常组外，其余各组均按“1.4”项下方法进行造模，各组灌胃给予相应剂量药物，给药容量为10 mL/kg，连续28 d，每7 d测定1次各组小鼠体质量和血糖值。第29 天，所有小鼠麻醉处死后摘眼球取血，并收集肝脏组织。

1.6 血清脂质水平、肝组织HG、MDA水平及SOD、GSH-Px活性检测 全血于4 ℃下3 000 r/min离心10 min，取血清；肝组织匀浆后离心取上清，按试剂盒说明书检测血清TC、TG、INS水平，肝组织中HG、MDA水平及SOD、GSH-Px活性。

1.7 RT-qPCR法检测Akt、PI3K、IRS1、PDK1、GLUT2、PIP5K、GSY、GSK-3βmRNA表达 按照Omega试剂盒说明书提取肝脏组织总RNA，按照FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix试剂盒说明书将提取所得RNA样品逆转录为cDNA(反应条件为42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min)，分装后于-20 ℃保存，用于后续实验。以cDNA为模板，使用委托北京擎科科技有限公司合成的引物(表1)进行实时荧光定量PCR扩增反应，观察并分析熔解曲线。每个样品设置3个复孔，以β-actin为内参，2-ΔΔCT法计算目的基因mRNA相对表达量。

表1 引物序列

1.8 Western blot法检测Akt、PI3K、IRS1、PDK1、GLUT2、PIP5K、GSY、GSK-3β蛋白表达 提取小鼠肝组织总蛋白，参考朱琪等[12]方法进行Western blot检测。

2 结果

2.1 糖尿病小鼠模型的建立 观察发现，模型组饲养箱内垫料潮湿，是排尿增多的表现。如图1所示，与正常组比较，模型组小鼠空腹血糖值升高(P<0.01)，出现进食、饮水量增多(P<0.01)，但体质量却减轻(P<0.05)的生理反应，表明造模成功。

2.2 黄精多糖对糖尿病小鼠血糖的影响 由表2可知，与正常组比较，模型组小鼠血糖水平升高(P<0.01)；与模型组比较，黄精多糖各剂量组第7～28 天血糖水平均降低(P<0.05，P<0.01)，其中黄精多糖高剂量组效果较优。

表2 黄精多糖对小鼠血糖的影响

2.3 黄精多糖对糖尿病小鼠血清TC、TG、INS及肝组织HG水平的影响 如图2所示，与正常组比较，模型组小鼠血清TC、TG水平均升高(P<0.01)，血清INS和肝组织HG水平均降低(P<0.01)；与模型组比较，黄精多糖各剂量组小鼠血清TC、TG水平均降低(P<0.05，P<0.01)，血清INS和肝组织HG水平均升高(P<0.05，P<0.01)，其中黄精多糖高剂量组效果较优。

2.4 黄精多糖对糖尿病小鼠肝组织SOD、GSH-Px活性和MDA水平的影响 如图3所示，与正常组比较，模型组小鼠肝组织SOD、GSH-Px活性降低(P<0.01)，MDA水平升高(P<0.01)；与模型组比较，黄精多糖各剂量组小鼠肝组织SOD、GSH-Px活性升高(P<0.05，P<0.01)，MDA水平降低(P<0.05，P<0.01)，说明黄精多糖可能通过缓解氧化应激以及因氧化应激造成的糖代谢异常，调节葡萄糖的氧化分解，达到调节血糖的作用。

2.5 黄精多糖对糖尿病小鼠肝组织中参与糖代谢关键基因表达的影响 由图4可知，与正常组比较，模型组小鼠肝组织Akt、PI3K、IRS1、PDK1、GLUT2、PIP5K、GSYmRNA表达均降低(P<0.01)，GSK-3βmRNA表达升高(P<0.01)，说明糖尿病小鼠胰岛素受体信号转导障碍，葡萄糖利用率和转运能力降低，葡萄糖合成糖原的能力减弱；与模型组比较，黄精多糖中、高剂量组均能上调Akt、PI3K、IRS1、PDK1、GLUT2、PIP5K、GSYmRNA表达(P<0.05，P<0.01)，下调GSK-3βmRNA表达升高(P<0.05，P<0.01)，说明黄精多糖可能通过上调PI3K提高胰岛素与IRS1结合能力并激活Akt，改善机体胰岛素信号的转导，且对葡萄糖转运能力和糖原合成能力均有改善作用。

2.6 黄精多糖对糖尿病小鼠肝组织中参与糖代谢关键蛋白表达的影响 如图5所示，与正常组比较，模型组小鼠肝组织中Akt、PI3K、IRS1、PDK1、GLUT2、PIP5K、GSY蛋白表达均降低(P<0.01)，GSK-3β蛋白表达升高(P<0.01)；与模型组比较，黄精多糖各剂量组均能上调Akt、PI3K、IRS1、PDK1、GLUT2、PIP5K、GSY蛋白表达(P<0.05，P<0.01)，下调GSK-3β蛋白表达(P<0.05，P<0.01)，说明黄精多糖提高胰岛素与胰岛素受体结合能力的同时，促进糖原合成和葡萄糖的转运，改善机体血糖水平。

3 讨论

糖尿病的病因和发病机制复杂，已被证实的病因包括有胰岛素分泌不足以及胰岛素缺陷作用等，从而诱发肝脏胰岛素抵抗、肝糖原合成降低[13-15]。现代西药包括促胰岛素分泌剂类、胰岛素增敏剂、磺脲类药物、双胍类等均被应用于治疗糖尿病。临床实验已证明这些药具有显著的降血糖效果，但存在增加心血管疾病风险、肝肾功能减退、过敏反应、胃肠道毒性等一系列不良反应或并发症[6]，如何有效防治糖尿病并且降低糖尿病并发症,从而减轻患者的痛苦，已成为全世界关注重点[16]。部分中药具有降血糖的作用，在降低患者血糖水平的同时，还可防治糖尿病的并发症，在现有的中药资源基础上，开发更高效、更安全、更廉价的防治糖尿病的中药活性成分成为热点[17-19]。本实验结果表明，各剂量黄精多糖均能起到降血糖的效果。高TC、TG水平是糖尿病患者特点之一，同时也能提示心血管疾病的发生[20]。各剂量黄精多糖均能改善糖尿病模型小鼠血清TC、TG水平，同时，还能改善血糖，血清中INS，肝脏中SOD、GSH-Px活性和MDA、HG水平，说明黄精多糖可在一定程度上通过改善糖脂代谢和缓解氧化应激等途径调节糖脂代谢、降低血糖。肝脏是葡萄糖代谢和调节血糖浓度的主要器官之一，通过磷酸戊糖途径、糖异生途径等维持机体内血糖浓度稳定[21]。胰岛素在维持血糖平衡的过程中具有关键性作用，其中Akt/PI3K信号通路被认为是胰岛素发挥调控血糖作用的关键靶点，许多研究表明，通过干预PI3K-Akt等通路可达到降血糖作用[22-23]。本研究结果显示，黄精多糖能上调PI3K、Akt、IRS1、PDK1、GLUT2、PIP5K、GSYmRNA表达，说明黄精多糖能通过激活IRS1-PI3K-PDK1-Akt信号通路，提高胰岛素分泌并促进胰岛素与胰岛素受体相结合，提高机体消耗葡萄糖的能力[24-25]。而文献研究表明，肝脏内Akt和GSK-3β磷酸化后可激活GSY，促进糖原合成[26-28]。本研究证明，黄精多糖通过激活PI3K-Akt-GSK-3β-GSY信号通路促进肝脏内消耗葡萄糖合成糖原。此外，活化的Akt也能作用于PIP5K和GLUT2，调控机体对葡萄糖的转运与吸收[29-30]。黄精多糖通过激活PI3K-Akt-PIP5K-GLUT2促进葡萄糖的转运，提高葡萄糖的利用和转化，增加外周组织对葡萄糖的利用。

综上所述，黄精多糖能通过降低肝脏中SOD、GSH-Px活性和MDA水平缓解机体氧化应激造成的糖代谢紊乱，能通过激活肝脏中IRS1-PI3K-PDK1-Akt、PI3K-Akt-GSK-3β-GYS、PI3K-Akt-PIP5K-GLUT2信号通路改善机体血糖水平，具有预防糖尿病的作用。